前言脊髓损伤(spinal cold injury,SCI)患者中有60%-90%在损伤发生后会出现中枢性疼痛(central pain,CP)。中枢性疼痛是一种神经性疼痛综合征,是由脊髓损伤或脑损伤导致的疼痛过敏,其引起的下肢疼痛往往持续存在并难以忍受,给患者带来了极大痛苦,因此脊髓损伤后发生的中枢性疼痛是临床医生不得不面对的难题。目前对于脊髓损伤后中枢性疼痛的发生机制尚不是十分清楚。近年来越来越多的研究认为脊髓损伤后大脑结构和功能的重塑可能是脊髓损伤后中枢性疼痛的重要原因。在我院前期工作中,我们运用了磁敏感加权成像技术(SWI),对脊髓损伤患者的大脑功能重塑情况展开了研究。发现:脊髓损伤后中枢性疼痛患者脑内铁离子超载的区域和大脑结构功能重塑的区域很相似(包括感觉皮层、丘脑等区域)。这意味着颅内铁离子超载可能参与了中枢性疼痛的发病。研究发现,颅内铁离子超载在一些中枢神经系统疾病,例如阿尔兹海默病、帕金森病、脑出血等疾病的发生发展中起着重要作用。以往的研究认为铁离子的毒性与通过Feteon反应直接引起神经元的氧化应激损伤有关,近年来研究发现,铁离子超载可以激活脑内的小胶质细胞,参与到神经元损伤的启动和放大过程。激活的小胶质细胞可以调节细胞因子如IL-1β、TNF-a以及过氧化物NO的水平;这些前炎症细胞因子或活性氧化分子所形成的级联效应进入恶性循环,最终导致神经元的损伤或丢失。同时又有研究证实:小胶质细胞的活化,可能跟细胞内NF-κB信号通路的活化有关。1.研究目的本研究希望能够通过实验了解铁离子超载及小胶质细胞激活在脊髓损伤后中枢性疼痛中发挥的作用。为应用NOS抑制剂、铁螯合剂、小胶质细胞激活抑制剂治疗脊髓损伤后中枢性疼痛提供理论基础。2.材料与方法本研究共分为四个部分:(1)脊髓损伤后中枢性疼痛模型构建及评价雌性SD大鼠75只,随机分成5组每组15只。假手术组:仅行椎板切除术,未损伤脊髓,不做任何特殊处理。脊髓损伤组:采用Allen氏重物坠击法制作脊髓损伤模型,不做任何特殊处理。NOS抑制剂组:造模后应用左旋精氨酸(L-arginine)干预。铁螯合剂组:造模后应用去铁胺(deferoxamine DFX)干预。小胶质细胞激活抑制剂组:造模后应用米诺环素(minocycline)干预。通过对手术后大鼠对后肢和尾部修饰、搔抓、舔咬及自发嘶叫等自发痛现象对大鼠自发痛作出评定,并使用智能热板仪测定手术后大鼠后肢热痛敏潜伏期(PWL)以评定诱发痛水平。(2)脊髓损伤后脑内铁离子的积累情况:采用原子吸收分光光度法测定大鼠全脑及后肢感觉区、丘脑、扣带回组织铁含量。(3)脊髓损伤后脑内铁离子超载发生机制采用Real-time PCR法测定各组大鼠后肢感觉皮层、扣带回、丘脑等区域内转铁蛋白受体1(Tf R1)m RNA的表达水平。采用ELISA法测定各组大鼠初级感觉皮层、丘脑、扣带回中转铁蛋白受体1(Tf R1)以铁蛋白(Fn)含量。采用Western Blot检测各组大鼠后肢感觉皮层内铁调节蛋白1(IRP1)、铁蛋白(Fn)、乳铁蛋白(Lf)和NF-κB含量(4)脊髓损伤后小胶质细胞活化及其发生机制通过免疫组织化学染色法观察大鼠后感觉皮层内小胶质细胞活化情况和IRP1含量。本文统计学处理均采用SPSS17.0软件进行统计学分析,实验结果以x?s表示,选用均值差t检验进行组间比较,P<0.05则认为差异有显著性。3.结果:(1)神经源性疼痛的动物模型的自发痛主要表现为对损伤平面以下搔抓、噬咬现象。脊髓损伤后大鼠出现对损伤部位以下躯体、后爪和尾部的噬咬、搔抓等过度修饰行为,严重的甚至出现自残;而假手术组中未观察到以上现象发生。脊髓损伤组热痛阈值较其余各组明显降低(p<0.05)。观察各组各时间节点热痛潜伏期可见假手术组在各组间处于较高水平,而脊髓损伤组处于较低水平。(2)各组全脑铁含量比较未见明显差异。后肢感觉区、扣带回、丘脑铁含量测定结果发现假手术组上述脑区中铁含量较其余各组明显降低(p<0.05),脊髓损伤组及小胶质细胞激活抑制剂组上述脑区中铁含量较其余各组明显升高(p<0.05)。(3)通过WB法对各组大鼠后肢感觉区IRP1、Fn、NF-κB、LF含量测定,可发现假手术组后肢感觉区中IRP1、NF-κB含量较其余各组明显降低(p<0.05),而Fn含量较其他各组明显升高(p<0.05)。脊髓损伤组中IRP1、NF-κB含量较假手术组、NOS抑制剂组、铁螯合剂组明显升高(p<0.05);Fn含量较假手术组、NOS抑制剂组、铁螯合剂组明显降低(p<0.05)。使用NOS抑制剂可以降低脊髓损伤后IRP1、NF-κB含量,提高Fn含量。使用铁螯合剂可降低脊髓损伤后NF-κB含量,提高Fn含量,对IRP1含量无影响。使用小胶质细胞激活抑制剂对上述蛋白含量无影响。各组中LF比较未见明显差异。通过ELISA法对各组大鼠后肢感觉区、丘脑、扣带回中Tf R1、Fn、含量测定,可发现假手术组各脑区中Tf R1含量较其余各组明显降低(p<0.05),而Fn含量较其他各组明显升高(p<0.05)。脊髓损伤组中Tf R1含量较假手术组、NOS抑制剂组、铁螯合剂组明显升高(p<0.05);Fn含量较假手术组、NOS抑制剂组、铁螯合剂组明显降低(p<0.05)。使用精氨酸可以降低脊髓损伤后Tf R1含量(p<0.05),提高Fn含量(p<0.05)。使用去铁胺后可提高脊髓损伤后Fn含量(p<0.05),对Tf R1含量无影响。使用米诺环素对Tf R1、Fn蛋白含量无影响。通过RT-PCR法对各组大鼠后肢感觉区、丘脑、扣带回中Tf R1基因含量测定可发现假手术组各脑区中Tf R1基因含量较其余各组明显降低(p<0.05),脊髓损伤组中Tf R1基因含量较假手术组、NOS抑制剂组明显升高(p<0.05);使用精氨酸可以降低脊髓损伤后Tf R1含量(p<0.05)。(4)通过对各组大鼠后肢感觉区内的小胶质细胞进行免疫组化法染色可观察到:脊髓损伤后小胶质细胞数量明显增加激活状态使用NOS抑制剂、铁螯合剂、小胶质细胞激活抑制剂干预后,小胶质细胞数目减少且激活程度减低。通过对各组大鼠后肢感觉区内的IRP1进行免疫组化法染色可观察到:脊髓损伤后IRP1数量明显增加,使用NOS抑制剂干预后,IRP1含量减少。4.结论(1)采用Allen氏重物坠击法建立大鼠脊髓损伤模型可以诱发损伤平面以下的中枢性神经性疼痛;(2)脊髓损伤后大鼠全脑铁含量保持恒定。丘脑、扣带回、后肢感觉区出现了IRP1升高、Tf R1升高、Fn降低,铁离子含量增高,后肢感觉区出现了小胶质细胞的激活;(3)使用NOS抑制剂干预可以使大鼠脑内丘脑、扣带回、后肢感觉区内IRP1降低、Tf R1降低、Fn升高,降低上述脑区内铁含量,抑制后肢感觉区内小胶质细胞激活,增高损伤平面以下热痛阈值;(4)通过铁螯合剂干预可以使大鼠脑内丘脑、扣带回、后肢感觉区内Fn升高,降低上述脑区内铁含量,抑制后肢感觉区内小胶质细胞激活,增高损伤平面以下热痛阈值;(5)采取小胶质细胞激活抑制剂干预可以使抑制大鼠脑内后肢感觉区内小胶质细胞激活,增高损伤平面以下热痛阈值;(6)在脊髓损伤后存在着如下通路导致了中枢性神经性疼痛的发生:脊髓损伤引起应激状态→下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活→糖皮质激素的异常增高→一氧化氮合酶激活→NO自由基增多→铁调节蛋白/铁反应元件活化→颅内铁离子超载→NF-κB信号通路活化→小胶质细胞激活→脑功能性重构→中枢性神经性疼痛产生。(7)应用NOS抑制剂、铁离子螯合剂、小胶质细胞抑制剂能够使得脊髓损伤后中枢性神经性疼痛症状得到缓解。