【摘 要】
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该研究构建了双功能诱导型表达和分泌载体pSBPTQ.由大肠杆菌高拷贝质粒pSP72和枯草杆菌高拷贝质粒pUB18共整合构建了穿梭型克隆载体pSB,在pSB上插入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因
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该研究构建了双功能诱导型表达和分泌载体pSBPTQ.由大肠杆菌高拷贝质粒pSP72和枯草杆菌高拷贝质粒pUB18共整合构建了穿梭型克隆载体pSB,在pSB上插入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因的启动子和信号肽序列sacB p.s.、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的转录终止序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,构建了能够在大肠杆菌中复制、在枯草杆菌中表达外源基因的诱导型表达分泌载体pSBPTQ.利用PCR技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白N端1-76位氨基酸(CGA1-76)的DNA片段,并将之克隆进pSBPTQ,获得重组质粒pSVTQ.用感受态细胞法将重组质粒pSVTQ转化三个蛋白酶缺陷和degU(Hy)表型的枯草杆菌DB1342,SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明:DB1342(pSVTQ)经蔗糖诱导后,CGA1-76获得表达并分泌到细胞外,摇瓶发酵表达水平为5 mg/L.抑制真菌药敏实验结果证明,重组CGA1-76在4 μmol/L水平就具有抑制白假丝酵母、镰刀菌和链格孢霉菌的作用.为了寻找高效低毒的抗真菌药物,利用PCR技术扩增了编码人嗜铬粒蛋白N端18-76、18-66和31-76位氨基酸(CGA18-76、CGA18-66和CGA31-76)的DNA片段,将之克隆进枯草杆菌诱导型表达载体pSBPTQ,构建了三种重组质粒,转化枯草杆菌DB1342,获得枯草杆菌工程菌DB1342(pSC18-76)、DB1342(pSC18-66)和DB1342(pSC31-76).在摇瓶发酵条件研究的基础上,用5 L发酵罐研究了枯草杆菌工程菌DB1342(PSC18-66)的高密度发酵.通过连续补料和蔗糖诱导,发酵24 h,细胞生物量达到53 OD600,表达产物分泌量达到25 mg/L.发酵上清经硫酸铵沉淀浓缩后,表达产物用DEAE-Sephadex A 25离子交换层析和Sephadex G 75分子筛层析进行纯化.
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