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涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是常见的唾液腺恶性肿瘤之一,约占头颈部恶性肿瘤的1%[1]。目前对于该肿瘤的治疗还是以手术为主的综合治疗,但是因为该肿瘤恶性程度高,侵袭性强以及转移率高,患者的预后较差。近年来,随着分子生物学发展,Ki-67、Bcl-2等靶点基因治疗应用较多,但治疗效果却不尽人意。尽管如此,新的分子标记物及分子靶点的研究方兴未艾,继续探寻新的分子标志物及基因靶点疗法意义深远。第一部分BRD4在涎腺腺样囊性癌组织中的表达量目的:探究BRD4在涎腺腺样囊性癌组织及其对应的癌旁组织中的表达量,确定BRD4可以作为一个有效的治疗靶点。方法:选择30例腺样囊性癌患者肿瘤组织以及对应癌旁组织,采用了免疫组织化学方法检测BRD4在其中的表达情况。结果:免疫组织化学结果显示:在取得的30例肿瘤组织中,BRD4表达率高达80%。而在30例癌旁组织中,BRD4均为低表达。结论:BRD4在涎腺腺样囊性癌组织中高表达,可以作为肿瘤治疗的一个有效靶点基因。第二部分腺样囊性癌对BRD4蛋白抑制剂JQ1的治疗不敏感目的:在涎腺腺样囊性癌的治疗中,采用BRD4蛋白抑制剂JQ1单独治疗时的效果如何?我们据此设计进一步的实验。方法:先将Acc-83细胞孵育24小时后,分别给予0.2μM,1μM,5μM剂量的JQ1,用CCK8检测1-4天肿瘤细胞的增殖情况。24h后,流式细胞术检测Acc-83细胞的凋亡水平。同时检测凋亡相关指标cleaved caspase-3的表达水平。结果:JQ1能抑制Acc-83的细胞活性,但是当JQ1浓度达到5μM时,Acc-83细胞活性降低到最大,仅有对照组的30%。结论:涎腺腺样囊性癌中,当采用JQ1单独治疗时,效果不佳,即肿瘤细胞对JQ1不敏感。第三部分JQ1抑制BRD4和c-Myc的表达,激活EGFR信号通路目的:探究JQ1在单独治疗腺样囊性癌中,与c-Myc和EGFR信号通路是否有关,并检测相应的通路变化,探寻治疗机制。方法:使用western blot分别检测0.2μM,11μM,5μM剂量的JQ1治疗后BRD4、c-Myc、pEGFR及EGFR相关蛋白表达水平,再用qRT-PCR检测c-Myc及EGFR mRNA的表达水平。结果:Western blot结果显示:随着JQ1浓度的升高,BRD4和c-Myc的表达逐渐降低,而EGFR及pEGFR蛋白的表达升高;qRT-PCR结果示:随着JQ1浓度升高,c-Myc的表达逐渐降低,而EGFR表达水平却升高,这与前面western blot结果一致。结论:JQ1能够通过c-Myc信号通路,发挥抗癌作用;但同时激活了 EGFR的激酶通路,引起治疗抑制。第四部分采用JQ1与PI3K的抑制剂BKM120联合治疗,可以显著提高治疗效果目的:我们将采用JQ1和PI3K抑制剂BKM120行联合治疗,并检测联合治疗后涎腺腺样囊性癌效果如何,初步探究其潜在机制。方法:实验分为JQ1(5μM)组,BKM120(1μM)组,联合治疗组以及对照组,分别检测了 Acc-83细胞系的增殖及凋亡水平;用western blot检测BRD4,c-Myc,EGFR以及pEGFR蛋白的表达水平,用qRT-PCR检测EGFR和c-Myc mRNA的表达。结果:CCK8检测结果显示:与单一药物治疗相比,JQ1和BKM120联合治疗组显著抑制了 Acc-83细胞的增殖。Western blot显示:JQ1和BKM120联合治疗组中,BRD4和c-Myc的蛋白表达量均明显下降;联合治疗组中,EGFR的表达量明显低于JQ1单独用药组(P<0.05),但略高于BKM120组;qRT-PCR进一步证实了这结果。结论:JQ1和BKM120协同用药治疗,能够同时抑制EGFR和c-Myc两条信号通路,提高Acc-83对JQ1的敏感度,显著提高治疗效果。第五部分EGFR的表达量显著影响腺样囊性癌对JQ1治疗的敏感度目的:涎腺腺样囊性癌中,探讨EGFR的表达量是否影响JQ1的治疗效果。方法:我们先用siRNA沉默了 EGFR,将实验分为siEGFR组,JQ15μM组,siEGFR+JQ1 5μM组以及对照组。Acc-83细胞转染成功2天后,CCK8检测了 1-4天各组肿瘤细胞增殖;24h后,检测各组凋亡水平。采用qRT-PCR以及Western-blot检测BRD4、c-Myc的表达水平。结果:CCK8检测结果示:JQ1+siEGFR组细胞增殖降低明显低于其他组(P<0.05);同时cleaved caspased-3的表达水平明显增加。Western blot结果显示JQ1+siEGFR组中BRD4和c-Myc表达明显降低,qRT-PCR结果也证实了 western blot结果。结论:涎腺腺样囊性癌中,EGFR的表达量可以显著影响JQ1的治疗效果,即影响肿瘤细胞对JQ1的敏感度。