在高等植物中,配子体的发生是植物顺利完成有性生殖的关键,而生殖细胞的特化是有性生殖起始。在拟南芥雌蕊中,远离胚柄端的胚珠中心一个体细胞特异膨大分化形成大孢子母细胞,从而开始雌性生殖系的发育过程。在大孢子母细胞的形成过程中,可能存在一种侧抑制机制,使得胚珠中有且仅有一个体细胞增大分化为大孢子母细胞。胚珠原基中体细胞间的细胞间信号传导对于大孢子母细胞命运决定也至关重要的,但周围体细胞间信号交流调控单个大孢子母细胞特化的分子机制还远未明确。本实验室前期研究发现染色质重塑复合物SWR1成员ARP6调控了大孢子母细胞发生过程中的减数分裂,通过转录组筛选我们获得了另一个调控了大孢子母细胞发生过程中的减数分裂基因细胞色素P450家族成员KLU。随后,通过双突变体构建,我们发现arp6klu双突变体胚珠中出现了多个类似大孢子母细胞的增大细胞,表明ARP6和KLU遗传互作,共同调控了大孢子母细胞的特化;随后通过比较转录组分析,鉴定了AR和KLU共同调控的下游基因WRKY28;更进一步通过细胞学、遗传学和分子生物学手段揭示了拟南芥染色体重塑复合物SWR1协同KLU调控WRKY28基因转录从而大孢子母细胞命运决定的分子机制。获得具体结果如下:1.通过比较转录组分析筛选到在大孢子发生时期胚珠内珠被原基特异表达基因——细胞色素P450家族成员KLU,染色质展片和FISH分析表明,该基因突变后大孢子母细胞减数分裂过程中同源染色体配对重组异常,表明KLU参与调控大孢子母细胞减数分裂过程中的同源染色体互作。2.arp6 klu双突变体结实率极低,遗传学互交实验和细胞学观察发现结实率低的原因主要来源于雌配子体的异常发育。双突变体早期胚珠中出现多个增大类似于大孢子母细胞的细胞,这些异常增大的细胞获得了大孢子母细胞的形态和分子特性,上述结果表明SWR1复合物和klu遗传互作共同抑制多个大孢子母细胞的形成。3.对比分析野生型、arp6、klu单突变体和arp6klu双突变体的花序转录组数据发现,在arp6klu双突变体的胚珠原基中转录因子WRKY28下调表达。利用定量PCR对比不同组织,如根、茎、叶、孢子母细胞特化时期的胚珠、成熟胚珠、小孢子母细胞分化时期的花药、成熟花药等组织中WRKY28的表达情况,发现WRKY28转录因子在大孢子母细胞特化时期的胚珠中特异高表达。4.制备WRKY28特异的抗体及探针,进行免疫组化和原位杂交分析表明WRKY28从大孢子母细胞特化开始,在大孢子母细胞周围的体细胞中特异表达,在大孢子母细胞完成减数分裂后停止表达,表明WRKY28在大孢子发生过程中的表达具有时空特异性。5.利用CRISPR-Cas9基因编辑和SRDX嵌合抑制子融合技术对WRKY28基因进行沉默或功能阻断,发现植株结实率下降,雌配子体发育异常,胚珠中存在多个增大的大孢子母细胞类似细胞,与arp6klu双突变体表型一致。在arp6klu双突变体中过表达WRKY28能部分回复胚珠中大孢子母细胞分化缺陷表型,双突变体的结实率也显著上升,表明WRKY28位于ARP和KLU下游调控大孢子母细胞特化和胚珠育性。6.利用H2A.Z抗体和花序组织进行ChIP-PCR研究发现,H2A.Z能直接结合在WRKY28基因的转录起始位点后第一个核小体上,并且H2A.Z在WRKY28基因上的富集程度在arp6突变体中显著降低。另外我们发现KLU突变导致ARP6和H2A.Z在WRKY28基因上的富集程度也显著降低,表明KLU可能通过招募染色质重塑复合物SWR1,调节组蛋白变体H2A.Z在WRKY28基因核小体上的沉积而激活WRKY28基因转录。综上所述,通过分析拟南芥arp6和klu单突变体及arp6klu双突变体中大孢子母细胞特化的表型,结合下游基因WRKY28基因沉默、时空表达和生化互作分析,本研究证明染色质重塑复合物SWR1协同细胞色素P450基因KLU,通过促进WRKY28的表达而调节大孢子母细胞的特化。转录因子WRKY28在胚珠的大孢子母细胞周围体细胞中的特异表达,抑制体细胞向大孢子母细胞的转变。植物的大孢子母细胞的特化对植物的雌性生殖系的发育和植株育性至关重要。本研究揭示了胚珠中只有单个细胞特化为生殖细胞的分子机制,为阐释植物有性生殖过程中细胞命运决定机制提供了重要参考。