本论文分为六章:第一章为基于药物体系的连翘饮药物提取工艺研究;第二章为基于药物体系的连翘饮药物大孔吸附树脂分离富集工艺研究;第三章为基于总成分含量的连翘饮药物制备物质量表征研究;第四章为基于有效指标性成分含量的连翘饮药物制备物质量表征研究;第五章为基于药学-药效的连翘饮药物制备物质量表征关联分析研究;第六章为总结与讨论。第一章基于药物体系的连翘饮药物提取工艺研究本论文在前期实验的基础上,以药物体系所体现的自然性、协同性、亲和性为线索发现与确定连翘饮抗菌药物体系。并根据药物体系药物的理化性质,选择总酚、总环烯醚萜及具有代表性的有效指标性成分(栀子苷、连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷)导向建立连翘饮药物的制备工艺。采用四因素三水平正交试验设计,以总酚、总环烯醚萜及有效指标性成分(栀子苷、连翘酯苷A、甘草酸、升麻素、连翘苷)的提取量为指标,对提取溶剂、提取次数、提取时间、溶剂倍量四个因素进行了考量,系统优选连翘饮药物提取工艺参数,并结合实际生产,确定最佳提取工艺为A2B3C3D2,即D2倍量A2乙醇回流提取B3次,每次C3小时。以最佳提取工艺制备三批样品,三批提取工艺验证结果为:平均出膏率为31.18%,总酚平均含量为22.55%,平均提取率为97.45%,总环烯醚萜平均含量为5.00%,平均提取率为91.74%,栀子苷平均含量为3.58%,平均提取率为95.17%,连翘酯苷A平均含量为0.32%,平均提取率为82.55%,甘草酸平均含量为1.19%,平均提取率为74.01%,连翘苷平均含量为0.11%,平均提取率为86.17%,升麻素平均含量为0.12%,平均提取率为94.70%。表明本连翘饮药物提取工艺稳定、可行。第二章基于药物体系的连翘饮药物大孔吸附树脂分离富集工艺研究对连翘饮药物大孔吸附树脂分离富集工艺进行了研究。以总酚和总环烯醚萜的最大吸附量和吸附-解吸率为考察指标,优选出用于富集纯化连翘饮抗菌药物的大孔吸附树脂;再分别对上样条件、除杂条件、总环烯醚萜部位洗脱条件及总酚部位洗脱条件等参数进行考量。最终建立了连翘饮药物大孔吸附树脂分离富集工艺:连翘饮复方饮片,D2倍量A2乙醇加热回流提取B3次,每次C3小时,合并提取液,减压回收乙醇、浓缩至原提取液的五分之一(60℃),加水分散,制成浓度为N1的上样液,D型大孔树脂,湿法装柱,径高比为J2,上样量与树脂体积比为B3,动态吸附,吸附流速为V2,吸附结束后,用SB3倍水洗脱除杂,水洗流速为SV2,然后用TC2乙醇洗脱,流速为TV3,洗脱MBV,收集TC2乙醇洗脱液,减压回收乙醇、浓缩、真空干燥,即得总环烯醚萜部位。再用FC4乙醇洗脱,流速为FV3,洗脱NBV,收集FC4乙醇洗脱液,减压回收乙醇、浓缩、真空干燥,即得总酚部位。三批工艺验证结果为:TC2乙醇洗脱部位平均出膏率为4.12%,总环烯醚萜平均含量为34.22%,平均转移率为87.95%;栀子苷平均含量为25.55%,平均转移率为92.18%;FC4乙醇洗脱部位平均出膏率为6.29%,连翘酯苷A平均含量为1.55%,平均转移率为71.84%;甘草酸平均含量为4.84%,平均转移率为60.88%;升麻素平均含量为0.56%,平均转移率为87.12%;连翘苷平均含量为0.54%,平均转移率为81.89%。TC2乙醇洗脱部位中总酚平均含量为35.09%,FC4乙醇洗脱部位中总酚平均含量为64.71%,2个洗脱部位总酚平均总转移率为77.58%。表明本连翘饮药物制备工艺稳定、可行。第三章基于总成分含量的连翘饮药物制备物质量表征研究基于药物体系,首次建立了连翘饮药物制备物总酚成分的可见分光光度定量分析方法。对三氯化铁-铁氰化钾显色条件进行考察,对显色反应进行方法学考察,以连翘酯苷A为对照品,建立连翘酯苷A的线性回归方程为Y=0.1307X+0.2721,r=0.9996(n=9)。表明连翘酯苷A在0.1512-4.6872μg/mL范围内吸光度(Abs)与浓度(μg/mL)具有良好的线性关系,平均加样回收率为98.37%,RSD=2.58%(n=6)。本方法准确、可靠、稳定性好,可作为基于总酚成分含量的连翘饮药物制备物的质量表征方法。并应用所建立的总酚含量测定方法基于总酚成分含量对连翘饮稀醇提取物、连翘饮TC2乙醇洗脱部位、连翘饮FC4乙醇洗脱部位及连翘饮复方饮片进行质量表征。测得三批连翘饮TC2乙醇洗脱部位中总酚的平均含量为34.75%,RSD=2.45%,连翘饮FC4乙醇洗脱部位中总酚的平均含量为64.71%,RSD=1.55%,连翘饮稀醇提取物总酚的平均含量为22.55%,RSD=2.57%,连翘饮复方饮片总酚的平均含量为7.11%,RSD=0.56%。以栀子苷含量折算出具有相同紫外吸收的同类物质的总含量,即栀子苷类成分的含量(总环烯醚萜类含量)。基于总环烯醚萜成分的含量进行连翘饮药物的质量表征研究。连翘饮复方饮片、连翘饮稀醇提取物、连翘饮TC2乙醇洗脱部位的总环烯醚萜平均含量为1.60%、4.92%、33.87%。第四章基于有效指标性成分含量的连翘饮药物制备物质量表征研究基于药物体系,建立了连翘饮药物制备物中有效指标性成分的HPLC含量测定方法,并对连翘饮复方饮片、连翘饮稀醇提取物、连翘饮TC2乙醇洗脱部位、连翘饮FC4乙醇洗脱部位进行质量表征。栀子苷的线性回归方程为Y=1251050X-13688.4,r=0.9999(n=6);连翘酯苷A的线性回归方程为Y=610093X-11458,r=0.9993(n=6);甘草酸的线性回归方程为 Y=641997X29482,r=0.9999(n=6);连翘苷的线性回归方程为Y=512876X-104.13,r=0.9999(n=7);升麻素的线性回归方程为 Y=2447630X-8967.16,r=0.9999(n=6);升麻素苷的线性回归方程为Y=1371000X-11693.43,r=0.9999(n=6);5-0-甲基维斯阿米醇苷的线性回归方程为Y=1475150X-14767.7,r=0.9999(n=5);甘草苷的线性回归方程为Y=1716700X-20126.2,r=0.9998(n=5)。实验结果表明栀子苷在0.680μg～4.080μg,连翘酯苷A在0.044μg～0.264μg,甘草酸在0.260μg～1.560μg,连翘苷在0.023μg～0.186μg,升麻素在0.030μg～0.247μg,升麻素苷在0.083μg～0.693μg,5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.101μg～0.505μg,甘草苷在0.101μg～0.505μg之间具有良好的线性关系。各有效指标性成分的加样回收率合格。本方法准确、简便、稳定、可行。测得连翘饮TC2乙醇洗脱部位中栀子苷的平均含量为26.2948%、升麻素苷的平均含量为2.8349%;连翘饮FC4乙醇洗脱部位中连翘酯苷A的平均含量为1.7458%、甘草酸的平均含量为4.8400%、升麻素的平均含量为0.5322%、连翘苷的平均含量为0.4839%、甘草苷的平均含量为2.3230%、5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量为1.4364%;连翘饮稀醇提取物中栀子苷的平均含量为3.5561%、升麻素苷的平均含量为0.4551%、连翘酯苷A的平均含量为0.3545%、甘草酸的平均含量为1.1900%、升麻素的平均含量为0.1258%、连翘苷的平均含量为0.1045%、甘草苷的平均含量为0.4430%、5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量为0.2897%;连翘饮复方饮片中栀子苷的平均含量为1.1400%、升麻素苷的平均含量为0.1547%、连翘酯苷A的平均含量为0.1360%、甘草酸的平均含量为0.5014%、升麻素的平均含量为0.0404%、连翘苷的平均含量为0.0381%、甘草苷的平均含量为0.1453%、5-O-甲基维斯阿米醇苷的平均含量为0.0996%。第五章基于药学-药效的连翘饮药物制备物质量表征关联分析研究本课题采用纸片扩散法,比较不同形式药物制备物在相同饮片量下,单独使用及与不同剂量的抗生素联用对金黄色葡萄球菌产生的抑菌圈直径大小,旨在考察连翘饮制备工艺所制备的药物的有效性。结果表明水提取物、稀醇提取物、富集物的抑菌圈直径分别为8.33mm、9.67mm、8.67mm,说明三种连翘饮药物制备物具有抗菌活性;同时发现连翘饮药物制备物联用抗生素后的抑菌圈直径比单独使用药物制备物或抗生素的抑菌圈直径增大,尤其在抗生素已无抗菌作用的剂量下(1/4K不产生抑菌圈,载药纸片直径为6mm),使水提取物、稀醇提取物、富集物抑菌圈直径增大,且体外抗菌作用大小顺序为:富集物≥ 稀醇提取物>水提取物。本课题采用金黄色葡萄球菌腹腔感染给药小鼠,观察给药小鼠的存活时间及死亡率,比较连翘饮药物制备物体内抗菌作用。实验结果:水提取物组小鼠7d内死亡率64.29%,平均存活时间为3.86天;稀醇提取物组小鼠7d内死亡率50.00%,平均存活时间为4.64天;富集物组小鼠7d内死亡率42.86%,平均存活时间为5.14天。与模型对照组相比,死亡率明显的降低,且存活天数也明显增加,说明水提取物、稀醇提取物、富集物对金黄色葡萄球菌感染的小鼠均有保护作用,且体内抗菌作用大小为:富集物>稀醇提取物>水提取物。同时富集物死亡率明显降低(P<0.05),死亡率与双黄连组相同,但平均存活时间比双黄连组要长,说明富集物比双黄连的药效要好,且连翘饮药物剂量生药量小。说明连翘饮药物制备物具有较好的体内抗菌作用。基于有效指标性成分的含量、相对比例、制备量及药物制备物出膏量对连翘饮药物制备物进行质量表征,分析药物体系药物的药学性质即含量、相对比例、制备量、制备率在药物制备物间的变化幅度,结合体内、外抗菌作用大小,进行药学-药效质量表征关联分析。发现相对饮片,富集物中甘草苷、栀子苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、升麻素苷、连翘酯苷A、连翘苷、甘草酸的含量分别提升至原饮片的9.65倍、9.13倍、8.71倍、7.96倍、7.89倍、7.75倍、7.67倍、5.83倍。说明有效指标性成分的含量变化与药效呈正相关,即富集物有效指标性成分含量增量变化值最大,药效最强。不同形式药物制备物之间相对比例变化幅度与含量变化幅度相比,总体变化不明显,相对于饮片,如升麻素苷在水提取物中相对比例为0.9404,在稀醇提取物中相对比例为0.9450,在富集物中相对比例为0.9924。其中连翘苷、连翘酯苷A、甘草苷、栀子苷变化相对较大,按大小排序为:连翘苷>连翘酯苷A>甘草苷>栀子苷,且在富集物中增长变化最大。且在一定的药物成分制备率范围内,药物成分在药物制备物中制备量的适当降低,未显现出对药物药效的关联影响。即在一定的药物成分制备率范围内,使关键有效成分含量显著提升、组成比例合理,则抗菌作用增强。在连翘饮三种药物制备物中,富集物以其有效指标性成分的含量最高、比例独特、出膏率低,药物用量小,抗菌作用最强,是连翘饮最佳药物制备物应用形式。第六章总结与讨论1以药物体系为导向,首次建立了连翘饮药物提取工艺和大孔吸附树脂分离富集工艺。2基于药物体系,首次建立了连翘饮药物制备物总成分及有效指标性成分的含量测定方法,并连翘饮药物制备物进行了质量表征研究。3首次基于连翘饮药物制备物药学-药效质量表征关联分析研究,发现并确定连翘饮最佳药物形式,为中药抗菌药物的研究提供新的制备导向模式和质量评价模式。