恶性肿瘤一直以来都威胁着人类的生活健康。在这其中,肝癌更是因其极高的病死率一直令人“闻风丧胆”。而作为肝病大国的中国,肝癌患者更是数目巨大,预后也往往不尽人意。虽然对于肝癌的研究一直是肿瘤领域的热点,肝癌的发病机制以及相关的分子靶标也在不断地被揭示,索拉菲尼的出现更是为广大肝癌患者带来了一线希望,但是由于肝癌本身不易在早期发现,而且进展迅速,发现病情时疾病往往已经进入中晚期,患者症状较为严重,错过了最佳的手术时机。另外,肝癌术后复发转移率不低,种种原因导致肝癌的平均生存期仅有6-20个月。因此,继续深入开展肝癌的相关研究,探索肝癌的发生发展机制,寻求新的分子标志物,开发新型靶向治疗药物,创造更为行之有效的肝癌治疗方法刻不容缓。Ras家族糖尿病相关基因RRAD是近些年来逐渐进入人们视野的一个基因。它在多篇报道中都被证实影响着肿瘤的发生发展过程,但是却未曾有关于它与肝癌关系的相关文献。之前有研究发现,在Ⅱ型糖尿病患者的骨骼肌组织中存在着一种新的表达量异常的Ras家族基因,于是研究人员将其命名为“Ras家族糖尿病相关基因”,这便是RRAD的由来。因其与糖尿病相关的特异性,不难想到RRAD可能与肿瘤的能量代谢具有关联。不同于正常组织细胞,肿瘤细胞更多地依赖有氧糖酵解来产生ATP,以供其发生发展,这一现象被称为“温伯格效应”。本文旨在研究RRAD在肝细胞肝癌发生发展过程中的作用机制,以期为今后肝癌的治疗带来新的方向。第一部分Ras家族糖尿病相关基因RRAD影响肝细胞肝癌的增殖、迁移、凋亡以及有氧糖酵解目的:RRAD在包括肺癌、卵巢癌、鼻咽癌等其他肿瘤中被证实与它们的进展相关,却未发现其与肝细胞肝癌的关系。本部分实验旨在阐明RRAD对肝癌进展过程中增殖、迁移、凋亡以及糖代谢的影响。方法:1.对组织芯片进行免疫组织化学染色,研究癌与癌旁组织中的RRAD表达差异,并联系患者的临床资料分析相关性及生存预后情况。2.分别在不同的肝癌细胞株中确定RRAD的表达水平,并构建RRAD的干扰与过表达细胞模型。3.在构建的细胞模型中,运用CCK-8、EdU检测其对肝癌细胞增殖能力的影响。4.在构建的细胞模型中,运用流式细胞术分析其对肝癌细胞周期的影响,并通过免疫印迹检测相关蛋白的改变。5.在构建的细胞模型中,运用流式细胞术分析其对肝癌细胞凋亡的影响,并通过免疫印迹检测相关蛋白的改变。6.在构建的细胞模型中,运用划痕实验、Transwell实验检测其对肝癌细胞迁移能力的影响。7.在构建的细胞模型中,检测其对细胞温伯格效应的影响,包括糖摄取的影响、乳酸产量的影响、细胞外成酸率的影响,并通过免疫印迹检测相关蛋白的改变。8.将构建的细胞模型注射入裸鼠皮下,分析RRAD对肝癌在动物体内成瘤能力的影响。结果:1.根据组织芯片的结果,RRAD在肝癌中相对低表达,且其表达水平影响了肝癌的肿瘤体积和TNM分期,并影响患者的生存预后。2.当RRAD被敲低后,肝癌细胞的增殖能力增强,反之,得到相反的结果。3.当RRAD过表达后,肝癌的细胞周期阻滞在G0/G1期,相关调控蛋白表达水平下降,反之,得到相反的结果。4.当RRAD过表达后,肝癌的细胞凋亡增加,相关调控蛋白的表达水平升高,反之,得到相反的结果。5.当RRAD过表达后,肝癌的细胞迁移能力增强6.当RRAD过表达后,肝癌细胞糖摄取和乳酸产量下降,细胞外成酸率下降,相关蛋白GLUT1表达上升,反之,得到相反的结果。7.裸鼠成瘤中,RRAD过表达的肿瘤细胞成瘤能力减弱,瘤体组织的糖酵解相关蛋白GLUT1表达下降,凋亡相关蛋白剪切体PARP、剪切体caspase-3表达上升。结论:1.RRAD在肝癌中相对低表达,且其表达水平影响了肝癌的肿瘤体积和TNM分期,并影响患者的生存预后。2.RRAD能抑制肝癌细胞的增殖、迁移能力,促进肝癌细胞的凋亡,并调节温伯格效应。3.RRAD能影响肝癌细胞在动物体内的成瘤能力。第二部分Ras家族糖尿病相关基因RRAD通过调节ACTG1影响肝细胞肝癌的生物学功能目的:前序研究已证实,RRAD在肝癌中具有抑癌作用,然而,其影响肝癌发生发展的分子机制尚不明确。本部分实验目的在于研究RRAD影响肝细胞肝癌生物学功能的分子机制。方法:1.利用String数据库预测可能与RRAD产生互作的蛋白,通过免疫共沉淀(co-ip)和质谱分析RRAD的互作蛋白,并利用GST-pulldown实验反向验证,寻找RRAD的互作蛋白。2.证实ACTG1与RRAD互作后,利用慢病毒载体建立过表达ACTG1基因的稳转细胞系:SK-Hep-1细胞,同时利用发卡RNA(shRNA)建立低表达ACTG1的稳转细胞系:Huh-7细胞。3.在构建的细胞模型中,运用与上部分实验中相同的方法分析ACTG1对肝癌细胞增殖能力、细胞周期、凋亡能力、温伯格效应的影响,并探讨RRAD与ACTG1的上下游关系,探索两者影响细胞功能的分子机制。4.收集肝细胞肝癌患者组织,通过RT-PCR验证肝癌组织与癌旁组织中RRAD、ACTG1的表达情况,并结合临床数据资料,分析两者与临床资料的相关性以及对患者生存预后的影响。5.通过裸鼠皮下种植成瘤,分析RRAD、ACTG1对肝癌在动物体内成瘤能力的影响。结果:1.Co-ip、质谱及GST-pulldown实验证实RRAD与ACTG1互作。2.当ACTG1过表达后,肝癌细胞的增殖能力增强,周期进展加速,凋亡比率下降,有氧糖酵解得到促进,相应的调控蛋白表达改变,反之,得到相反的结果。3.当RRAD过表达后,ACTG1的mRNA水平下降,蛋白表达水平下降。4.裸鼠成瘤中,RRAD过表达的肿瘤细胞成瘤能力减弱,瘤体组织的糖酵解相关蛋白GLUT1表达下降,同时过表达RRAD和ACTG1的肿瘤细胞成瘤能力得到恢复,瘤体组织的糖酵解相关蛋白GLUT1表达水平回复。5.根据患者组织标本的结果,RRAD在肝癌中相对低表达,且其表达水平影响了肝癌的肿瘤体积和TNM分期,并影响患者的生存预后;ACTG1在肝癌中相对高表达,且其表达水平影响了肝癌的TNM分期,并影响患者的生存预后。对两者行联合生存分析表明,高表达RRAD同时低表达ACTG1的肝癌患者预后最好。结论:RRAD在肝癌中具有抑癌作用,而其互作蛋白ACTG1在肝癌中有促癌作用。RRAD位于ACTG1上游,通过调节ACTG1影响肝癌的增殖、凋亡、糖代谢等生物学功能。