在G蛋白偶联受体(G protein—coupled receptors，GPCRs)的研究领域中，目前非G蛋白对受体的调控是研究的热点。mGluR5是一种调节中枢神经系统重要的G蛋白偶联受体，其羧基末端具有PDZ蛋白的结合序列：ST/SL序列，可以与PDZ蛋白特异性结合。我们推测PDZ家族的某些成员有可能与mGluR5相结合而调节其生理性质。 利用GST融合蛋白沉降技术在兔脑中筛选与mGluRs的羧基末端(Carboxyl terminus，CT)相结合的PDZ蛋白，发现mGluR5—CT可以与CAL相结合。CAL是2001年被克隆出的PDZ蛋白，CAL与mGluR5的相互作用未见报道。因此本实验拟在前期研究的工作基础上，研究mGluR5与CAL在细胞内的相互作用及其调控机制。 通过体外实验(GST融合蛋白沉降实验)和细胞水平实验(免疫共沉淀和细胞免疫荧光)证实二者的相互作用。应用RT-PCR、Western blot等方法研究二者相互作用对mGluR5生理功能的影响。结果如下： 1.与mGluR5—CT相互作用的CAL蛋白的发现 利用GST融合蛋白沉降技术筛选兔脑中与mGluR5—CT相结合的蛋白。沉降复合物用考马斯亮蓝染色，发现与对照组单独的GST蛋白沉降兔脑脑组织复合物相比，实验组GST—mGluR5—CT大约在60KD，75KD，80 KD的位置能沉降下蛋白。在前期研究的基础上，根据分析差异点的等电点与分子量的不同，利用Western blot方法证实了其中一种蛋白为PDZ蛋白CAL。 2.CAL/mGluR5在体外的相互作用 (1)用GST—mGluR5—CT融合蛋白与CAL的PDZ结构域进行GST融合蛋白沉降实验，相对于GST对照组在GST—mGluR5—CT沉降复合物中能够检测到大量的CAL-PDZ蛋白片段的存在。将mGluR5羧基末端四个氨基酸(S—S—S—L依次为—3，—2，—1，0位)分别突变为丙氨酸，发现：在—1、—3位的突变体沉降复合物中检测到CAL蛋白的量明显少于野生型，而在0和—2位的突变体沉降复合物中检测不到CAL蛋白的存在。说明mGluR5羧基末端四个氨基酸中0位亮氨酸和—2位丝氨酸对mGluR5/CAL的结合起决定作用。 (2)用GST—mGluRs—CT及0位突变体SSSA与CAL完整蛋白质分子进行GST融合蛋白沉降实验，结果发现在GST—mGluR5—CT wt沉降复合物中能够检测到大量的完整蛋白质CAL的存在，与(1)结果一致，0位突变体沉降复合物中检测不到CAL的存在，进一步证实了0位亮氨酸(L)的重要性。 3.CAL/mGluR5在细胞内的相互作用 (1)运用免疫共沉淀技术，免疫沉淀mGluR5后，免疫印迹检测HA—CAL，在单独转染HA—CAL的细胞内，免疫沉淀复合物中检测不到HA—CAL蛋白；而在共转染HA—CAL和Flag—mGluR5的细胞内，可在其免疫沉淀复合物中检测到HA—CAL。 (2)运用细胞免疫荧光技术，将HA—CAL与Flag—mGluR5分别单独转染至BHK细胞中，mGluR5主要分布在BHK细胞膜上，胞浆内亦有弥散分布；CAL弥散分布于BHK细胞中。将HA—CAL与Flag—mGluR5共转染至BHK细胞中，发现mGluR5主要分布在细胞膜上，CAL在mGluR5影响下由胞浆移至细胞膜上，且二者共定位于细胞膜上。 4.CAL促进mGluR5蛋白表达 CAL能促进mGluR5的表达并且具有剂量依赖性(P<0.01)，且CAL蛋白不增加细胞内mGluR5基因的转录(P<0.01)。 结论： 1. mGluR5的羧基末端与CAL的PDZ结构域特异性结合。 2. CAL对mGluR5表达调控的影响：CAL能促进mGluR5的表达并且具有剂量依赖性，且不增加细胞内mGluR5基因的转录。