论文部分内容阅读
凡纳滨对虾是我国重要的对虾养殖品种,对虾的生长速度直接决定养殖的经济效益。对虾幼体到成体的肌肉生长速度取决于肌蛋白的合成速度和降解速度。研究发现,肌细胞肌原纤维的降解是由钙蛋白酶引起的,钙蛋白酶系统的钙蛋白酶抑制蛋白可以抑制肌细胞的分解,肌蛋白降解速度相对降低会导致肌肉生长速度的增加,也会提高摄入营养物质的肌肉转化效率。本研究通过RACE方法克隆了凡纳滨对虾的钙蛋白酶B (Calpains, Calp-B)、钙蛋白酶D (Calpains, Calp-D)、钙蛋白酶M (Calpains, Calp-M)基因的部分序列,并对3个基因的序列进行了分析。结果如下：1.首次克隆获得了凡纳滨对虾的Calp-M基因,通过设计简并引物,从凡纳滨对虾的肌肉组织中获得该基因,其cDNA序列长度为597bp,有一个507bp的开放阅读框(ORF),编码169个氨基酸,通过氨基酸序列比对得知,凡纳滨对虾Calp-M编码氨基酸的序列高度保守,与其他物种的相似性很高,达到27.81%,因此确定该基因为凡纳滨对虾的Calp-M基因。Calp-M属于亲水性蛋白,Calp-M蛋白理论等电点为4.656,分子量为19.350KDa。其NC值为46.54,α-螺旋区域(Alpha helix)占18.34%；p-折叠区域(Extended strand)27.81%;无规则卷曲区域(Random coil)53.85%;其发生磷酸化的激活位点分别为11个丝氨酸(Ser)位点、7个苏氨酸(Thr)位点、6个酩氨酸(Tyr)位点。2.克隆获得了凡纳滨对虾Calp-B基因,用RACE的方法获得了长度为1739bp的cDNA序列,921bp的开放阅读框,编码307个氨基酸,分子量为35.732K Da,等电点为6.502,该蛋白的氨基酸序列中含有39个碱性氨基酸,45个酸性氨基酸,96个疏水性氨基酸,63个极性氨基酸。通过氨基酸序列比对得知,凡纳滨对虾的Calp-B编码氨基酸的序列高度保守。对凡纳滨对虾Calp-B氨基酸预测到该蛋白含有1个完整的结构域,组成的4个结构域从N端起分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ结构域。四个区域均可能存在1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,1个N-糖基化位点,7个区域均为蛋白激酶C磷酸化位点,4个N-肉豆蔻酰,其中磷酸化位点和磷脂结合域。其结构域Ⅳ含有EF-手结构,与钙离子结合,调节其它生物活性。而通过对其信号肽分析得知,Calp-B是一种分泌蛋白,并且信号肽切割为点在33aa处,其跨膜区域,对其功能的发挥有一定的作用,Calp-B蛋白的二级结构,α-螺旋区域(Alpha helix)是由99个氨基酸组成,占32.25%；p-折叠区域(Extended strand)是由63个氨基酸组成,占20.52%；无规则卷曲区域(Random coil)是由145个氨基酸组成,占47.23%。NC值为49.744,由此表明Calp-B为一种表达量不是很高的内源性基因。3.首次获得凡纳滨对虾体内Calp-D基因的部分cDNA的序列,其cDNA序列长度为623bp,其编码了307个氨基酸的蛋白前体,分子量为9.082K Da,等电点为5.522,该蛋白的氨基酸序列中含有9个碱性氨基酸,12个酸性氨基酸,26个疏水性氨基酸,15个极性氨基酸；Calp-D属于亲水性蛋白,通过生物信息学分析得知：Calp-D能存在1个氨酸激酶磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N-肉豆蔻酰位点和细胞粘附位点。NC值为50.331,表明Calp-D表达量不是很高的内源性基因,数据分析得知无规则螺旋占据大多数；并预测到磷酸化位点为4个丝氨酸、1个苏氨酸和1个络氨酸。