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研究目的：创面愈合是烧伤治疗的难题，多种因素影响往往导致创面愈合延迟，愈合后瘢痕增生。本研究对如何优化创面愈合，即加速上皮生长促进创面愈合、又可防止瘢痕过度增生进行了基因治疗的尝试。通过脂质体介导外源基因转导烧伤创面的手段，将Ⅰ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因联合转导烧伤创面，检测IGF-Ⅰ、HSV-tk的表达，观察IGF-Ⅰ对创面愈合的促进作用及HSV-tk／GCV对瘢痕增生的抑制作用，从而为基因治疗用于烧伤外科领域打下基础。研究方法：本研究共分两个部分内容。 第一部分IGF-Ⅰ和HSV-tk重组真核表达载体的构建。在已有的原核表达质粒pUChIGF-Ⅰ和pUChHyTk的研究基础上，利用PCR技术分别扩增IGF-Ⅰ和tk基因，将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1／IGF-Ⅰ和pcDNA3.1／tk。 本部分研究分为5步骤： 1．原核表达质粒pUChIGF-Ⅰ和pUChHyTk的分别PCR扩增，获取IGF-Ⅰ和HSV-tk基因DNA片段 2．IGF-Ⅰ和HSV-tk基因片段与载体pcDNA3.1体外重组 3．重组体pcDNA3.1／IGF-Ⅰ和pcDNA3.1／tk转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞 4．转化子的筛选和鉴定第一军医大学博士研究生学位论文嘟 5.重组质粒peDNA3 .1/IGF一I和peDNA3 .1/tk中插入基因IGF一I和tk的序列测定和分析 第二部分脂质体介导IGF一I和tk联合基因转移对烫伤大鼠创面愈合作用的研究。通过脂质体介导PcDNA3 .1/I GF一I、PcDNA3.1/tk重组质粒联合转染烫伤大鼠皮肤组织，观察烫伤大鼠体重、创面愈合情况等指标，并分别检测IGF一I和tk基因的表达情况。 可分为5项内容: 1.烫伤动物模型的制作和动物实验的实施、标本的获取 2.免疫组化染色检测IGF一I基因在创面局部及肝脏组织的表 达情况 3.放射免疫方法检测血清中IGF一I的水平 4.RT一PCR方法检测tk基因在创面局部的表达 5.透射电镜观察注射GCV后tk基因表达阳性的成纤维细胞 的凋亡结果:第一部分结果显示:重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致，DNA测序结果表明IGF一I和HsV一tk基因已分别正确插入到peDNA3 .1质粒，构建成功了各自的重组真核表达载体。 第二部分结果显示:免疫组化染色显示脂质体介导的IGF一I基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达，而肝脏组织中未出现阳性表达;RT一PCR检测脂质体介导tk基因也可在创面组织出现阳性表达;大鼠创面注射IGF一I重组质粒后，创面愈合较对照组显著加快(p<0.05)，大鼠体重同未注射IGF一I的大鼠比较未出现减轻现象(p<0.05);创面局部注射IGF一I重组质粒不会影响血清中IGF一I的水平;创面局部注射GCV后，可促进tk基因表达阳性的成纤维第4页第一军医大学博士研究生学位论文嘟细胞出现凋亡。本部分研究结果说明，脂质体介导的IGF一I和tk联合基因转移可以促进创面愈合，避免伤后体重下降，并可适当地控制瘫痕增生;研究结果同时也提示，创面局部实施基因联合转移所产生的生理效应，是局部基因表达的结果，不会对全身产生影响。结论:本研究采用基因工程技术，成功地将原核表达载体中的IGF一I和tk基因亚克隆至真核表达载体peDNA3 .1上，构建成功重组真核表达质粒peDNA3 .1/l GF一I和pcDNA3.1/tk;脂质体介导PcDNA3 .1/I GF一I和pcDNA3.1/tk到烫伤大鼠创面周围，可以观察到IGF一I和tk基因在注射点附近皮肤均可出现阳性表达;伤后适当时间注射GCV可以促进tk基因表达阳性的成纤维细胞出现凋亡;脂质体介导IGF一I和tk联合基因转移，可促进创面愈合，并对瘫痕增生有一定的抑制作用;本研究通过脂质体介导IGF一I和tk联合基因转移，为创面愈合提供了一条基因治疗的新思路。