斑马鱼DR-SARM基因的克隆与初步功能研究

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作为一种模式生物,斑马鱼在诸多领域得到研究者的青睐。近几年的积累,更使斑马鱼成为免疫学研究领域的一颗新星。斑马鱼中发现了高等动物TLR信号通路(Toll-like receptor signaling)l~大多数同源分子,预示着该通路在斑马鱼中的保守性,但功能方面的研究还有待深入的开展。在实验室建立的杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)感染斑马鱼的抑制性差减杂交(Suppression SubtractiveHybridization,SSH) cDNA文库中,我们发现了人类含TIR结构的接头分子SARM在斑马鱼中的同源分子DR-SARM。SARM在线虫中的同源分子已经被证明参与免疫功能,而最近的研究表明人类SARM分子是作为TLR-3和TLR-4介导的信号通路的一个抑制因子存在的。 DR-SARM基因定位于斑马鱼15号染色体,其编码的蛋白长713个氨基酸,具有三个保守的结构域,分别是TIR结构域(Toll-interleukin 1 receptor),SAM结构域(sterile a-motif)和 ARM结构域(Heat/armadillo-motif)。DR-SARM分子在进化上保守,与人类SARM的氨基酸同一性高达61%。 应用实时定量PCR的方法,我们研究了斑马鱼DR-SARM基因的组织表达模式,结果显示DR-SARM基因在斑马鱼大脑中有相对较高的表达。我们用细菌、病毒及病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)纯组分分别刺激斑马鱼,并分析刺激前后DR-SARM基因表达模式的变化。实时定量荧光PCR结果显示DR-SARM基因的mRNA拷贝数在杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)、脾脏肾脏坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)以及不同PAMPs的刺激下均出现不同程度的上调。为了研究DR-SARM的亚细胞定位情况,我们将DR-SARM与绿色荧光蛋白GFP融合,在HEK293T细胞中过量表达。绿色荧光显示DR-SARM在细胞浆表达,并且在细胞核的附近有聚集。我们进一步将GFP与缺失了特征结构域的DR-SARM突变体融合,发现SAM结构域可能对于DR-SARM在HEK293T细胞中的定位起重要作用。接下来,我们在HEK-293T细胞中过表达DR-SARM,发现其对NF-kappaB 和斑马鱼IFN报告基因均没有激活效应,这一结果与人类SARM的情况一致。但是,当我们将斑马鱼DR-TRIF和DR-MyD88分别与DR-SARM共转染HEK293T细胞时,发现DR-SARM对两个接头分子激活报告基因的效应都有抑制,这有别于人类SARM特异性抑制TRIF的现象。虽然这种抑制效应还需要进一步的实验来证实,但是我们有理由推测在斑马鱼中DR-SARM分子的功能可能与人类SARM存在差异。
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