背景与目的股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)是骨科常见病,病程长且致残率高。由于其发病机制尚未完全阐明,治疗比较困难,晚期多行人工关节置换,因此早期ANFH的治疗是关键。如何有效治疗早期ANFH,防止疾病进一步发展,延缓股骨头塌陷,一直是骨科研究的热点。近年来研究表明,ANFH与骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs )有着密切关系,认为是由于BMSCs的减少,导致的修复重建不足而引起股骨头塌陷。目前髓芯减压(core decompression CD)复合移植BMSCs治疗早期ANFH的报道越来越多,多选择抽取自体骨髓,简单分离后获取干细胞,直接注入坏死区。但该方法注入坏死区的BMSCs数量往往较少且附着能力差,影响了最终的治疗效果。为了获得更多BMSCs则需要使用异种血清在体外分离培养,但是异种血清存在潜在抗原性、致病性,限制了临床推广应用。干细胞移植治疗ANFH应解决以下几个关键问题:如何快速扩增培养自体间充质干细胞、有效黏附并减少干细胞流失、避免异体或异种血清带来的免疫反应、客观评价其临床疗效等。鉴于上述问题,我们采用自体血清扩增培养BMSCs,与人脱钙骨基质(demineralized bone matrix DBM)复合移植,结合髓芯减压治疗早期ANFH,探讨BMSCs移植治疗早期ANFH的有效性与安全性。方法实验分两部分一、自体血清体外扩增培养BMSCs实验研究1自体血清体外扩增培养BMSCs1.1一般资料选取第三军医大学附属西南医院收治的行BMSCs植入治疗的早期ANFH患者10例,男9例、女1例,平均年龄36.2岁(19～45岁)。其中,激素性2例,酒精性3例,特发性5例。所有入组ANFH患者对本实验均知情同意。1.2自体血清制备,BMSCs扩增培养及鉴定由输血科分次抽取200ml静脉血,通过密度梯度离心制备获取自体血清并冰冻保存备用。由自体血清配置培养基并采用密度梯度离心法结合贴壁分离筛选法进行BMSCs的体外扩增培养,每日在倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞生长状况和形态变化并做好专门的记录。随机抽取1名患者的P3细胞在流式细胞仪下行BMSCs表面标志物鉴定。2不同干扰因素对BMSCs增殖的影响2.1不同病因对BMSCs增殖的影响按病因将10例患者分为3组:激素组(2例)、酒精组(3例)、特发性组(5例)。2.2血清浓度对BMSCs增殖的影响A组:10%胎牛血清组,B组:5%自体血清组,C组:10%自体血清组, D组:15%自体血清组,E组:20%自体血清组。2.3 BMSCs体外扩增培养方法对以上分组均采用密度梯度离心法结合贴壁分离筛选法进行BMSCs的体外扩增和培养。2.4比较观察指标每日在倒置相差显微镜下观察每组细胞生长状况和形态变化并做好专门记录;分别计算传代细胞倍增时间(population doubling time,PDT):PDT = (t - t0) log2/ logN -logN0 ,其中,t - t0为给定培养期间;logN - logN0为给定培养期间增殖细胞数的对数差。2.5统计学方法采用SPSS17.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,P值<0.05有统计学意义。二自体血清培养BMSCs复合DBM移植结合髓芯减压治疗早期ANFH的初步临床观察1.一般资料8例双侧ANFH进入临床治疗,男7例、女1例,平均年龄35.7岁(19～43岁)。ARCO分期Ⅰ～Ⅲa期,按左右侧随机分为两组:A组即单纯股骨头髓芯减压组,B组即股骨头髓芯减压结合自体血清培养的BMSCs移植治疗组。2.手术方法股骨头髓芯减压:在C形臂X光机引导下从股骨粗隆下向股骨头坏死区平行钻入3个直径5.0mm孔,至股骨头软骨下骨。BMSCs移植治疗:将P3代BMSCs制成的细胞悬液与DBM复合;然后将BMSCs与DBM复合物充分充填于髓芯减压孔内。3.围手术期处理由指定医师对受试者围手术期的各项诊疗、随访观察和与受试者之间进行对其康复进程的长期动态交流,及时发现可能出现的问题,给予受试者有益的建议和帮助。4.有效性与安全性评估术前、术后、3、6、12月进行严格的临床随访,以后每6月随访一次,均进行Harris髋关节功能评分,VAS(visual analogue scale)疼痛评分、X线及MRI检查,同时观察血沉、C反应蛋白、肝功、肾功、IgM、IgG、IgA等指标;将各项指标通过t检验进行比较。5统计学方法采用SPSS17.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,P值<0.05有统计学意义。本研究通过医院伦理委员会的批准,患者知情同意后,签署知情同意书。结果1.原代培养细胞形态多呈梭形,约10～12d可达到90%细胞融合,呈特征性的旋涡状生长,排列有方向性。传代细胞的生长较原代快,一般于接种后4-5d进入对数增殖期,到第6～8天即可达到90%;不同病因患者体外扩增三代后均可获得足够的细胞数量;随机抽取P3代BMSCs表面标志物鉴定,可见样本细胞CD105呈阳性表达,CD34呈阴性表达。2.不同病因患者原代接种前获得的骨髓单核细胞数量不同,酒精性、特发性的ANFH患者离心后获得的单核细胞数量及扩增后获得BMSCs数量多于激素性ANFH患者(P<0.05);5%自体血清组和20%自体血清组均未完成原代和传代培养;相同病因10%胎牛血清组与10%自体血清组和15%自体血清组原代培养时间和传代PDT比较无统计学意义(P﹥0.05);激素性的原代培养时间和传代PDT与酒精性和特发性相比较要长,比较有显著差异(P<0.05)。酒精性、特发性的原代培养时间和传代PDT与比较无统计学意义(P﹥0.05)。3.所有8例患者手术过程顺利且均获随访,随访时间12～42个月,平均23.5个月。术后3个月疼痛、跛行等临床症状逐渐改善。术前及术后3、6个月两组Harris评分及VAS评分组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),术后12个月B组评分高于A组(P<0.05);术后各时间点两组Harris评分及VAS评分均较术前显著提高(P<0.05)。术后12个月X线及MRI检查发现A组1例IIIa期患者出现股骨头塌陷;B组术后12个月T1相低信号区所占股骨头体积的百分比为相比,差异有统计学意义(P<0.05);B组术后12个月T1加权像低信号区所占股骨头体积的百分比缩小。4.安全性评估:所有患者术后均未出现不良反应;HIV、HCV、HTV抗体、乙肝病毒PCR在术前及术后具有严格的一致性;术前及术后肝肾功、IgM、IgG、IgA均在正常范围;CRP、C3、C4术后1周明显升高,1个月恢复正常。结论1.股骨头缺血性坏死患者可以通过自体血清替代牛血清培养,获得高纯度、活性强的骨髓间充质干细胞,至少在3代内细胞生长旺盛且维持生物学特性;所获得的细胞数量可以满足临床治疗需要。2.酒精性、特发性ANFH患者BMSCs体外增殖能力较激素性ANFH患者强,酒精性和特发性相比较基本相似;10%胎牛血清组与10%自体血清组和15%自体血清组体外增殖能力相似,10%较为适合作为ANFH患者BMSCs体外培养的自体血清浓度。3.髓芯减压联合利用体外扩增的BMSCs复合DBM移植治疗早期ANFH,通过对临床试用者各时间观察点的功能评估,影像学评估、安全评估初步证实不仅疗效满意,而且具有较强的安全性。4.自体血清培养BMSCs移植结合髓芯减压与单纯髓芯减压治疗早期ANFH均有效,前者缓解疼痛及延缓塌陷方面优于后者。