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骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）的发生和发展是一种与人体生物力学密切相关的疾病。常见于老年女性,尤其多见于体力劳动者,其主要症状为膝关节的疼痛和活动受限。对于膝关节骨性关节炎严重的患者往往伴有下肢膝关节生物力线的改变。在细胞层面,骨性关节炎的发病机制为软骨基质的降解和软骨细胞的凋亡。既往研究主要集中于阐述软骨基质的降解和软骨细胞的凋亡以及膝关节关节腔内滑膜炎症的侵袭性改变。然而对于下肢生物力线改变对膝关节软骨细胞机械牵张应力生物信号的相关研究较少。本研究利用Flexcell机械牵张力学仪器构建体外软骨细胞的机械牵张应力模型,根据预实验的实验结果,将牵张应力实验组分成Oh机械牵张应力组;6h机械牵张应力组;24h机械牵张应力组;36h机械牵张应力组和72h机械牵张应力组。进而探究生物力学对软骨细胞的影响。以机械激活离子通道TRPV4蛋白为研究切入点,探究机械激活离子通道TRPV4通过钙离子作为第二信使,借由ERK5/MAPK信号通路激活凋亡基因的表达,从而促进机械牵张应力作用下软骨细胞的过度凋亡。利用ShRNA干扰技术,构建ShRNA-TRPV4干扰质粒,对TRPV4的基因进行基因沉默,利用慢病毒作为ShRNA-TRPV4干扰质粒的转染媒介,探究ShRNA-TRP4对机械牵张应力作用下软骨细胞过度凋亡的保护机制。研究结果表明ShRNA-TRPV4通过阻断机械激活离子通道TRPV4的表达,降低牵张应力细胞模型中钙离子含量,阻断ERK5/MAPK信号通路的表达,进而阻断凋亡基因的表达,对软骨细胞的凋亡起到保护作用。第一部分 TRPV4基因ShRNA干扰载体序列慢病毒载体的构建和筛选目的 利用ShRNA干扰技术,构建ShRNA-TRPV4干扰质粒,将慢病毒作为转染媒介,对ShRNA-TRPV4的干扰序列进行筛选方法 以人肾上皮细胞系293T细胞为研究对象,利用慢病毒作为转染媒介,以LV3质粒为载体,构建 ShRNA序列,构建3 种 ShRNA-TRPV4序列:LV3-TRPV4-homo-2899,LV3-TRPV4-homo-3207 和 LV3-TRPV4-homo-4108。利用慢病毒转染技术,将ShRNA-TRPV4转染人肾上皮细胞系293T细胞。利用倒置荧光显微镜观察慢病毒的转染效率。利用RT-PCR技术和Western Blot技术检测ShRNA干扰序列的表达。结果（1）根据Designer3.0（GenePharma）软件进行设计,针对TRPV4基因序列,设计三种 ShRNA TRPV4 干扰序列。（2）质粒 PLV3-ShRNA-ZsGreen-TRPV4 经XhoI酶切后用琼脂糖凝胶电泳可见线性化质粒条带,质粒酶切鉴定结果表明:hTRPV4-21#克隆为阳性克隆。（3）以以293T细胞为靶细胞,分别采用10-1,10-2,10-3,10-4μL病毒量进行转染,从而选择最优的病毒滴度。可见,MOI=50,10-1μL病毒量时转染效率最高。（4）RT-PCR检测结果显示:TRPV4-homo--2899序列组TRPV4-homo-3207序列组和TRPV4-homo-4108序列组以及阴性对照组比较具有统计学差异（F=18.219,P=0.000<0.001）;并且 TRPV4-homo-3207 序列组与另外 3 组相比,TRPV4-mRNA相对表达量明显减少,具有统计学差异（q=2.221,P=0.0192<0.05）。（5）Western-Blot 检测结果显示:TRPV4-homo--2899 序列组 TRPV4-homo-3207 序列组和TRPV4-homo-4108序列组以及阴性对照组TRPV4蛋白/β-actin蛋白的相对表达量比较具有统计学差异（F=21.327,P=0.000<0.001）;并且TRPV4-homo-3207序列组与另外3组相比,TRPV4-mRNA相对表达量明显减少,具有统计学差异（q=1.872,P=0.0215<0.05）。结论RNA干扰技术可以发挥基因沉默作用,利用慢病毒转染技术,以人293T细胞为靶细胞,TRPV4-homo-3207序列可以有效的沉默TRPV4基因的表达,可以作为有效干扰序列。第二部分:探究ShRNA-TRPV4通过ERK5/MAPK信号通路途径抑制机械牵张应力作用下软骨细胞过度凋亡的机制研究目的 探究ShRNA-TRPV4通过ERK5/MAPK信号通路途径抑制机械牵张应力作用下软骨细胞过度凋亡的机制。方法 人软骨细胞主要是取自我院关节外科行全膝关节置换术的软骨组织,采用免疫组化的实验方法对原代软骨细胞进行鉴定。Flexcell-4000T系统构建体外机械牵张应力软骨细胞模型,根据干预因素,设置牵张幅度为20%,变性和恢复的周期为6个循环/min;每次形变间隔时间为10秒。根据机械牵张应力的处理,ShRNA-TRPV4慢病毒转染与否以及ERK5的抑制剂BIX02188将软骨细胞分成如下分组:Oh机械牵张应力组,6 h机械牵张应力组,24 h机械牵张应力组,36 h机械牵张应力组,72 h机械牵张应力组。ShRNA-TRPV4慢病毒转染后,分组为:0 h机械牵张应力+ShRNA-TRPV4组,6 h机械牵张应力组+ShRNA-TRPV4组,24 h机械牵张应力+ShRNA-TRPV4组,36 h机械牵张应力+ShRNA-TRPV4组,72 h机械牵张应力+ShRNA-TRPV4组;经ERK5的抑制剂BIX02188处理后,分组为Oh机械牵张应力+BIX02188组,6 h机械牵张应力+BIX02188组,24 h机械牵张应力+BIX02188组,36h机械牵张应力+BIX02188组,72 h机械牵张应力+BIX02188组。利用第一部分构建的ShRNA-TRPV4慢病毒载体转染软骨细胞,免疫荧光染色定位TRPV4蛋白和ERK5蛋白的表达以及机械牵张应力处理后,TRPV4蛋白和ERK5蛋白的表达含量。荧光定量 PCR 检测 TRPV4,Caspase-3,Caspase-9 和 Caspase-12 的 mRNA的相对表达水平。Western-Blot检测TRPV4和ERK5的蛋白表达水平。Fluo-3,AM试剂盒检测细胞内钙离子含量。流式细胞仪和Hoechst染色检测各组细胞的凋亡率。结果（1）软骨细胞形态学可见,,第3代软骨细胞形态处于最佳状态,故此选择第三代软骨细胞作为后文研究的靶细胞。（2）甲苯胺蓝特异性结合软骨细胞细胞质中多聚蛋白多糖,从而使软骨细胞细胞质成紫红色,从而验证种子细胞的细胞特性,为下面的实验做准备。（3）P3代软骨细胞的Aggrecan免疫组织化学染色,可见细胞胞质内棕色染色较强,P3代软骨细胞中Aggrecan的高表达;Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色结果显示,可见细胞胞质内棕色染色较强,表达量较高。（4）ShRNA-TRPV4慢病毒转染软骨细胞,荧光下视野细胞显色为GFP绿色荧光蛋白显色,可见慢病毒已经转入软骨细胞内。慢病毒转染后48h慢病毒的转染效率为（52.6±2.9）%;慢病毒转染后72h慢病毒的转染效率为（87.4±11.4）%。（5）倒置光学显微镜形态学分析结果:6 h牵张应力对照组软骨细胞皱缩成凋亡小体只是零星分布于视野,24 h牵张应力对照组的软骨细胞皱缩成凋亡小体的比例要高于6 h牵张应力对照组。36 h牵张应力组软骨细胞凋亡小体的比例要低于24 h牵张应力对照组,72 h牵张应力组软骨细胞凋亡小体的比例要低于36 h牵张应力对照组。0 h机械牵张应力+ShRNA-TRPV4组与Oh牵张应力对照组软骨细胞相比无明显的区别,24h机械牵张应力+ShRNA-TRPV4组与24h牵张应力对照组软骨细胞相比,凋亡小体比例有所降低。36 h和72 h机械牵张应力+ShRNA-TRPV4组与36 h和72 h牵张应力对照组软骨细胞相比,具有同样的表达特点。Oh机械牵张应力+BIX02188组具有同样的表达特点。（6）免疫荧光染色定位软骨细胞TRPV4和REK5的蛋白表达,可见TRPV4蛋白是表达于软骨细胞细胞质中,并且随着机械牵张应力的加载时间的延长,24h机械牵张应力组TRPV4蛋白的表达量要明显高于其他机械牵张应力组。ERK5蛋白是表达于软骨细胞细胞质中,并且随着机械牵张应力的加载时间的延长,24 h机械牵张应力组ERK5蛋白的表达量要明显高于其他机械牵张应力组。（7）TRPV4 mRNA的相对表达量所示24 h机械牵张应力组的TRPV4 mRNA的相对表达量要明显高于6 h机械牵张应力组（P<0.05）和O h机械牵张应力组（P<0.05）;ERK5,Caspase-3,Bcl-2,BAD和Bax具有同样的表达特点。（8）Fluo-3,AM试剂盒检测机械牵张应力对照组和应力+ShRNA-TRPV4组软骨细胞内钙离子的含量结果显示24 h机械牵张应力组软骨细胞钙离子的荧光强度要明显高于6h机械牵张应力组（P<0.05）和Oh机械牵张应力组（P<0.05）;另外24 h机械牵张应力组软骨细胞钙离子的荧光强度要明显高于36 h机械牵张应力组（P<0.05）和72 h机械牵张应力组（P<0.05）;可见24 h机械牵张应力组软骨细胞钙离子的荧光强度处于峰值。（9）利用Westem Blot检测TRPV4蛋白的免疫条带结果所示,24 h机械牵张应力组的TRPV4蛋白的相对表达量要明显高于6 h机械牵张应力组（P<0.05）和0 h机械牵张应力组（P<0.05）;24 h机械牵张应力组的TRPV4蛋白的相对表达量处于峰值。而应力+ShRNA-TRPV4组中TRPV4蛋白的相对表达量明显低于牵张应力对照组（P<0.05）。（10）AV-PI试剂盒和Hoechst染色检测机械牵张应力对照组的软骨细胞凋亡结果,24 h机械牵张应力组的软骨细胞凋亡率要明显高于6 h机械牵张应力组（P<0.05）和0 h机械牵张应力组（P<0.05）;另外24 h机械牵张应力组的软骨细胞凋亡率要明显高于36 h机械牵张应力组（P<0.05）和72 h机械牵张应力组（P<0.05）;可见24 h机械牵张应力组的软骨细胞凋亡率处于峰值。结论 ShRNA-TRPV4通过阻断机械激活离子通道TRPV4的表达,降低牵张应力细胞模型中钙离子含量,阻断ERK5/MAPK信号通路的表达,进而阻断凋亡基因的表达,对软骨细胞的凋亡起到保护作用。