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1.遗传性视网膜疾病的分子遗传学分析遗传性视网膜疾病(Hereditary retinal diseases,HRDs)是一组临床上较为常见,以视力和视野等视功能严重受损为主要表现的致盲疾病。HRDs具有显著的临床异质性,同种疾病可有多种不同的临床表型,不同疾病的临床表现之间可有一定的相似性和交叉性,因而给临床诊断带来一定的挑战。此外,HRDs具有明显的遗传异质性,目前全世界已明确的致病基因有256个,已鉴定出的连锁位点高达293个(www.RetNet.org)。目前临床上尚缺乏有效的治疗手段,基因治疗是目前研究的一大热点。因此,明确HRDs患者分子遗传学病因,是将来根治HRDs的前提,具有非常重要的现实意义。在第一部分研究中,我们旨在探索HRDs患者的分子遗传学病因。(1)收集南京医科大学第一附属医院眼科诊治的一个三代常染色体显性遗传的家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy,FEVR)家系,共有四名家庭成员参与研究。扩增候选致病基因Norrie病(Norrie disease,NDP)基因,卷曲蛋白受体 4(frizzled class receptor4,FZD4)基因,低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LDL receptor related protein 5,LRP5)基因,四旋蛋白 12(tetraspanin 12,TSPAN12)基因和锌指蛋白 408(zinc finger protein 408,ZNF408)基因的全部编码区及外显子-内含子交界区剪切位点附近的序列,Sanger测序法检测该家系的潜在致病突变。遗传学检查结果证实了 FZD4 p.E160K为该家系的致病突变,晶体结构分析结果提示该突变能够引起第160号氨基酸位点与第152号天冬酰胺间的氢键消失,影响蛋白的三级结构和正常功能。结果证实了 p.E160K为FEVR的新突变位点。(2)收集了 2个常染色体视神经萎缩(Autosomal dominant optic atrophy,ADOA)家系,针对HRDs已知致病基因及连锁位点定制目标序列捕获芯片,同时构建了基于高通量二代测序(next-generation sequencing,NGS)的目标区域捕获测序平台,并且借助该分子诊断平台在这两个家系中进行了遗传突变的筛查。经过一系列筛选和过滤,家系内共分离验证和生物信息学分析,最终明确了 基因新突变p.Y305C和p.L65V为这两个家系的致病基因突变。一方面辅助了临床诊断,另一方面进一步扩展了突变的遗传谱。综上,目的基因的直接筛查和基于NGS平台的目标区域捕获测序能够帮助HRDs家系进行快速、高效、精准的遗传突变检测,从而辅助临床诊断,并且为产前诊断奠定基础和后续的基因替代治疗提供重要的理论依据。2.与人类视网膜色素变性相关的基因小鼠模型SNRNP200 p.S1090L的研究视网膜色素变性(retinal pigmentosa,RP)属于光感受器细胞及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)营养不良性退行性病变,是一种最常见的遗传性致盲眼病。主要临床特征为夜盲,视野进行性缩小,典型表现为视网膜色素沉着呈骨细胞样改变。RP为单基因遗传病,根据遗传方式可分为常染色体显性遗传 RP(autosomal dominant retinis pigmentosa,ADRP),常染色体隐性遗传 RP(autosomal recessive retinis pigmentosa,ARRP)和性连锁 RP(X-linked retinis pigmentosa,XRRP)。U4/U6-U5 小核核糖核蛋白三聚复合体(triple small nuclear ribonucleoprotein,tri-snRNP)相关的基因突变能够导致ADRP,目前已知的这类致病基因包括PRPF3、PRPF4、PRPF6、PRPF8、PRPF31 和 SNRNP200。其中,SNRNP200基因编码的蛋白是U5 snRNP的重要组成部分,在U4/U6二聚体解链过程中起着十分重要的作用。此前我们本课题组及其他课题组的研究已经证实了SNRNP200 p.S1090L为RP的致病热点突变,为了探究SNRNP200基因突变的致病机制,我们通过Crisper-Cas9基因编辑技术,构建了SNRNP200p.S1090L小鼠模型。研究结果发现,在该小鼠模型中,突变的等位基因表达的蛋白被降解,纯和突变的小鼠胚胎致死,并且蛋白一半的表达量足够维持小鼠视网膜的发育和视功能。研究初步证实了,单倍剂量不足不是该病的致病机制。