食醋,可能也只有食醋是一种全世界消费者普遍认可的酸性调味品。按照原料的不同,食醋可分为以高粱、稻谷和小麦等谷物为原料酿造的谷物醋,以及以葡萄和苹果等水果为原料酿造的果醋。其中,谷物醋的传统生产方法为固态发酵,主要产自中国和日本等东方国家,代表产品包括:中国四大传统名醋（山西老陈醋、镇江香醋、四川保宁醋和福建永春红曲醋）和日本的黑醋;果醋的传统生产方法为液态发酵,主要产自意大利、西班牙和美国等西方国家,代表产品包括:意大利的香醋（Balsamic vinegar）、西班牙的雪莉醋（Sherry vinegar）和美国的苹果醋等。无论是谷物醋还是果醋,特别是以传统方法酿造的,都被认为具有抑菌、抗氧化、控制血糖、调节血脂、减肥、抗癌和预防骨质疏松等多种生物活性功能。过去食醋相关功能特性的系统研究主要集中于西方的果醋和日本的黑醋,而食醋中功能性成分的分离与结构鉴定则主要集中于日本的黑醋。我国是一个食醋酿造和消费大国,有3000多年的食醋酿造历史,诞生了以四大传统名醋为代表的多种谷物醋。其中,传统的山西老陈醋是以高粱、麸皮、大麦和豌豆等多种谷物为原料,采用固态发酵,经熏醅和陈酿等独特工艺酿造而成的谷物醋,以绵、酸、香、甜、鲜等特征居于中国四大传统名醋之首。但是过去关于其功能特性和相关物质基础的研究不够系统,主要在抑菌、抗氧化,以及降血脂功能等方面进行了一些研究;在功能性成分的分离鉴定方面,尽管目前已知山西老陈醋含有阿魏酸、川芎嗪、γ-氨基丁酸和类黑精等功能性成分,但这些成分没有一种是首先从山西老陈醋中分离鉴定得到的。鉴于山西老陈醋生产原料的多样性和生产工艺的独特性,结合前期实验初步发现,我们预计在山西老陈醋中应该还存在一些未知的功能性成分。晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products,AGEs）是由羰基类化合物与蛋白质、脂质或核酸中的游离氨基通过非酶作用形成的一类不可逆产物的总称。研究显示,人体内或膳食中AGEs的含量越高,发生糖尿病、心血管疾病和癌症等疾病的风险越大,所以抑制体内外AGEs产生对预防和控制这些疾病的发生非常重要。研究还发现,降低p H值、提高抗氧化和清除活性羰基等,能有效抑制AGEs产生,据此我们认为富含有机酸、多酚类化合物和类黑精,具有抗氧化和清除活性羰基等能力的山西老陈醋是很好的AGEs抑制剂,但具体机理和物质基础还不清楚。为此,本研究以抑制AGEs形成的能力为主要评价指标,首先分析发现,山西老陈醋中抑制AGEs形成的成分主要存在于其乙醇提取物中;进一步分析发现,尽管乙醇提取物中的酚酸对AGEs形成有一定的抑制作用,但其浓度较低,应该不是主要的抑制成分。故采用乙酸乙酯萃取和半制备液相分离相结合的方法,对乙醇提取物中的成分进行了进一步分离,得到了极性由大到小的V1-V7,7个组分。通过分析各组分抑制AGEs形成等功能特性,发现山西老陈醋乙醇提取物的功能性成分主要存在于V2、V4、V6和V7中,其中V6抑制AGEs形成的能力最强。进一步采用半制备液相色谱、LC-MS/MS和NMR方法,从V6和V7中同时分离鉴定得到一个广谱抑菌化合物——苯乳酸,并发现其普遍存在于食醋中。在此基础上,为了探究食醋中苯乳酸的来源,分析发现了一株能产苯乳酸的醋酸菌,葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter sp.）FBFS97。为了提高该醋酸菌产苯乳酸的能力,将高产苯丙氨酸大肠杆菌（Escherichia coli）NST37中与苯乳酸合成相关的aroGfbr和pheAfbr基因共表达于FBFS97中,构建了一株能以葡萄糖为原料产苯乳酸的菌株,FBFS97-aroGfbr。主要结果如下。1葡萄糖-异亮氨酸模拟体系的构建及其在评价山西老陈醋抑制AGEs形成中的应用目前测定某种样品（成分）抑制AGEs形成能力的常用方法是在葡萄糖-牛血清白蛋白（BSA）或油酸-BSA体系中加入一定量的样品,通过测定反应体系中的荧光强度（激发波长370 nm、发射波长440 nm）来衡量该样品抑制AGEs形成的能力。此方法虽简便易行,但不适合山西老陈醋等在该条件下能产生强背景荧光的样品。为此,本研究首先构建了一种适合山西老陈醋等能产高背景荧光样品的葡萄糖-异亮氨酸体系,通过茚三酮法检测反应体系中残留的异亮氨酸,来评价山西老陈醋对AGEs形成的抑制能力。采用该体系分析发现,山西老陈醋抑制AGEs形成的能力,随陈酿年份（0、1、2、3和5年）的增加而增强。然后,以无水乙醇,按食醋:乙醇5:1（V/V）的比例,将陈酿5年的山西老陈醋分成乙醇提取物（Ethanol extract,EE）和残留物（Ethanol residue,ER）两部分。通过分析它们抑制AGEs形成的能力,发现山西老陈醋抑制AGEs形成的能力几乎全部存在于EE中,ER不能抑制AGEs的形成。进一步分析了抑制AGEs形成的机理,结果显示,虽然山西老陈醋的抗氧化能力主要存在于ER中,其自由基清除能力、总还原力和过渡金属离子螯合能力分别为山西老陈醋的56.3%、69.0%和88.5%,但是山西老陈醋对活性羰基的清除能力主要存在于EE中,且ER中还具有促进糖基化作用的还原酮结构,这可能也是ER无AGEs形成抑制能力的主要原因。由于本研究的主要研究目的是寻找山西老陈醋中抑制AGEs形成的成分,所以在以下实验中仅对5年陈酿山西老陈醋的EE组分进行进一步研究。2山西老陈醋乙醇提取物对AGEs形成的抑制及其功能性成分的分离鉴定2.1酚酸的鉴定及其AGEs形成抑制能力的分析通过高分辨率质谱筛选,结合酚酸标品比对分析,从山西老陈醋乙醇提取物中鉴定得到了8种酚酸,其按浓度（0-5μg/g）从大到小分别为:原儿茶酸＞二氢阿魏酸＞二氢芥子酸＞对羟基苯甲酸≈水杨酸≈对香豆酸＞阿魏酸≈芥子酸。由于上述几种酚酸在AGEs形成的葡萄糖-BSA和油酸-BSA模拟体系中不存在荧光干扰,所以用这两种体系对其中含量较高且具有代表性的5种酚酸（原儿茶酸、二氢阿魏酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸和水杨酸）的AGEs形成抑制能力进行了分析。结果显示,各酚酸在油酸-BSA体系中抑制AGEs形成的能力是其在葡萄糖-BSA体系中的10倍以上,在油酸-BSA体系中,当酚酸浓度达到0.01-0.1 mg/m L时,能显著抑制AGEs的形成。两个体系中酚酸抑制AGEs形成能力的巨大差异,可能与酚酸能较好地抑制油酸-BSA体系中脂肪酸的过氧化,促进葡萄糖-BSA体系中葡萄糖氧化产生羰基化合物,以及不能清除活性羰基的性质有关。尽管酚酸在油酸-BSA体系中具有较强的AGEs形成抑制能力,但分析发现5年陈酿山西老陈醋中的酚酸总浓度约为0.02 mg/m L,根据山西老陈醋在模拟体系中的稀释度100倍计算,酚酸在模拟体系中的浓度仅约为0.0002 mg/m L,远低于单一酚酸纯品抑制AGEs形成的最低有效浓度0.01mg/m L。因此,在山西老陈醋乙醇提取物中可能还存在其他AGEs形成抑制成分,故对乙醇提取物进行了进一步分析研究。2.2乙酸乙酯萃取分离物对AGEs形成的抑制及其功能性化合物的分离鉴定2.2.1乙酸乙酯萃取物的分离及其AGEs形成抑制能力的分析首先将山西老陈醋的乙醇提取物真空旋蒸浓缩,后采用乙酸乙酯萃取浓缩物,萃取物经半制备液相色谱分离得到7个组分,按极性由大到小分别编号为V1-V7。对各组分的AGEs形成抑制、活性羰基清除、脂肪酸过氧化抑制和抗氧化等能力进行了分析,结果发现,山西老陈醋乙酸乙酯萃取物中抑制AGEs形成的成分主要存在于V6中,其在油酸-BSA和葡萄糖-BSA中的半抑制浓度（IC50）分别为0.006mg/m L和0.085 mg/m L,仅为其他组分IC50的1/10左右;活性羰基清除能力也主要存在于V6中,其清除能力是其他组分的1.6-2.8倍;脂肪酸过氧化抑制能力主要存在于V6和V7中,其抑制能力比其他组分高10%-94%;而抗氧化能力则主要存在于V2和V4中,为其他组分的2-3倍。由于除V6和V7外,其他组分中的成分较为复杂,非常难得到纯度较高的单一化合物,故功能性化合物的分离鉴定主要集中在V6和V7中进行。2.2.2苯乳酸的分离鉴定及其在食醋中的含量采用半制备液相分离、LC-MS/MS和NMR从V6和V7中同时分离鉴定到一个广谱抑菌化合物——苯乳酸。但进一步分析发现,苯乳酸并无显著抑制AGEs形成、脂肪酸过氧化和清除活性羰基的能力,故推测在V6和V7中应该还存在其他抑制AGEs形成的成分,有待进一步研究。收集来自9个国家的77种谷物醋和果醋样品,分析了它们的苯乳酸含量,发现苯乳酸广泛存在于食醋中,并发现谷物醋中苯乳酸含量（0-979.97 mg/L）普遍高于果醋的含量（0-22.77 mg/L）。其中,中国四大名醋中苯乳酸含量为122.03-979.97 mg/L。3一株产苯乳酸醋酸菌的发现及其以葡萄糖为原料产苯乳酸能力的改造为了探究山西老陈醋中苯乳酸的来源,分析了其原辅料和各酿造阶段物料中苯乳酸的含量,发现山西老陈醋中的苯乳酸主要由酒精和醋酸发酵阶段的微生物产生。并从实验室保藏的醋酸菌中筛选发现1株能产苯乳酸的醋酸菌——葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter sp.）FBFS97。这是首次发现醋酸菌能产苯乳酸。过去,产苯乳酸的微生物主要为乳酸菌,需以苯丙氨酸（100元/kg）或苯丙酮酸（3000元/kg）为底物,成本较高,未实现工业化生产。为此,本研究将大肠杆菌（Escherichia coli）NST37中与苯乳酸合成相关的aroGfbr和pheAfbr基因共表达于葡糖醋杆菌FBFS97中,改造其苯乳酸的合成途径,构建了1株能以葡萄糖为原料产苯乳酸的醋酸菌,FBFS97-aroGfbr,其苯乳酸的产量为135 mg/L,与已报道的乳酸菌等微生物产苯乳酸的最高水平相当。