肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤首位。目前针对肺癌的治疗主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等方法，多数肺癌患者在其病程的不同时期均需要接受化疗治疗。临床常用的化疗药物虽然抗肿瘤作用确切、疗效显著，但有骨髓抑制、消化道反应等毒副作用及肿瘤耐药等问题，严重影响患者对药物的耐受性和治疗效果，所以迄今为止临床化疗的效果仍不能令人满意，为肺癌治疗上的难点。　　近年来从中药中提取分离得到的抗肿瘤成分如:三尖杉碱、紫杉醇等抗肿瘤药物，已经成为临床上肿瘤治疗的常用药物。从植物中提取的天然化合物因其广泛的生物活性、低毒性和较少的副作用而备受关注。山楂酸(Maslinic acid)是从油橄榄、红枣、枇杷叶、山楂等植物中分离得到的一个三萜类天然有机化合物，分子式C30H48O4，分子量为472.70。油橄榄中富含山楂酸，橄榄油是地中海沿岸各国人民传统食用油，具有非常好的营养保健作用，此外还被广泛应用于美容保健。地中海沿岸居民的体质强壮、寿命长，那里的心血管病、癌症、老年痴呆症，三大疾病的发病率非常低。在我国，山楂酸多从枇杷叶中提取，枇杷广泛分布于中南及陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、四川、贵州、云南等地，全年皆可采收。山楂酸对人体的高安全性及多种生物活性，引起了人们极大的研究兴趣。近年来的研究表明，山楂酸具有诸多药理活性，如抗癌、抗氧化、抗艾滋病病毒、抗菌、抗糖尿病以及血管舒张、降胆固醇等作用。国内对山楂酸抗肿瘤相关研究较少，近年国外研究发现，山楂酸对人结肠癌HT29细胞、人前列腺癌DU145细胞、小鼠黑色素瘤细胞等有较强的抗肿瘤活性，其中部分作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡相关。目前为止，山楂酸对肺癌的影响国内外尚未见报道。显然山楂酸是一个非常有研究价值的天然产物，它可以作为抗肿瘤药物深入研究，具有广阔的应用前景。　　MicroRNA(miRNA)是19～24nt的非编码小分子单链RNA，广泛存在于哺乳动物细胞中，在基因的转录和翻译、细胞分化和个体发育、遗传和表观遗传等生命活动中发挥重要的调控作用。近年来的研究证明miRNA的改变在人类肿瘤中广泛存在，miRNA在肿瘤发生发展过程中均发挥重要作用。miRNA直接或间接调控癌基因或抑癌基因表达，是近年来肿瘤研究热点。研究发现与肺癌相关的miRNA有Let-7、miR-17-92、miR-21、miR-155、miR-200c、miR-126、miR-34、miR-31等几十种。它们在肺癌中表达升高或降低，调节转录后翻译，促进或抑制肺癌的发生和发展。通过分子生物学方法将肺癌中某些特定miRNA的表达增强或抑制后，可以抑制肺癌的增殖，起到治疗肺癌的作用。最近研究发现，某些药物也可以调节肿瘤细胞中miRNA的表达升高或降低，进而通过调节转录后翻译发挥其抗肿瘤作用。miRNA可以作为药物治疗肿瘤的新靶点，在肿瘤新药的开发、药物抗肿瘤机制研究中发挥重要作用。　　本实验研究山楂酸对肺癌A549细胞的抑制作用以及基于microRNA调控的分子机制，为深入研究山楂酸抗肿瘤机制提供实验基础，为应用于临床治疗肺癌提供理论依据。　　实验材料与方法:　　一、山楂酸对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响的研究采用四甲基偶氮噻蓝(MTT)法检测山楂酸对A549细胞增殖的影响;采用流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡;荧光显微镜观察细胞核的形态变化;采用Western blotting方法检测山楂酸对凋亡相关蛋白Caspase-3，9的表达的影响。　　二、山楂酸与顺铂合用对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响的研究　　采用四甲基偶氮噻蓝(MTT)法检测山楂酸、顺铂单独应用以及合用对A549细胞增殖的影响;采用流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测山楂酸、顺铂单独应2用以及合用对细胞凋亡的影响;荧光显微镜观察山楂酸、顺铂单独应用以及合用对细胞核的形态变化的影响;采用Western blotting方法检测山楂酸、顺铂单独应用以及合用对凋亡相关蛋白XIAP、Survivin的表达的影响。　　三、MicroRNA在山楂酸对肺癌A549细胞抑制作用中的研究　　利用AFFX miRNA表达谱芯片检测山楂酸作用前后A549细胞中miRNA表达差异，筛选出山楂酸抑制A549细胞作用的靶miRNA，预测细胞增殖相关靶基因及细胞凋亡相关靶基因。　　实验结果:　　一、山楂酸对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响　　MTT法检测结果显示随着浓度的加大，山楂酸对A549细胞的增殖有明显的抑制作用，呈现明显的剂量效应关系，与对照组相比差异具有显著性。流式细胞检测细胞凋亡率表明随着山楂酸浓度的增高，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，与对照组相比差异具有显著性。荧光电子显微镜观察山楂酸作用后的细胞中可见染色体边集、核碎裂等典型的凋亡改变，而对照组没有相应的变化。经过不同浓度山楂酸处理A549细胞24小时后，Western blotting方法检测结果显示，随着山楂酸浓度的不断增加，Caspase-3，9蛋白表达水平逐渐降低，CleavedCaspase-3，9蛋白表达水平逐渐增加。　　二、山楂酸与顺铂合用对肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响的研究　　MTT法检测结果，山楂酸、顺铂单独应用均可抑制A549细胞的增殖，二者合用明显增强对A549细胞的增殖抑制效应，与对照组相比差异具有显著性。流式细胞检测细胞凋亡率表明山楂酸、顺铂单独应用均可引起A549细胞凋亡，二者合用明显增加A549细胞凋亡率，与对照组相比差异具有显著性。荧光电子显微镜观察山楂酸、顺铂单独作用A549细胞后细胞核形态均发生显著性改变，呈现染色质浓缩、核固缩、核片断化，二者合用时凋亡细胞明显增多，核碎裂明显，细胞大片脱落形成细胞脱失区。Western blotting方法检测结果显示，山楂酸、顺铂单独应用均可降低XIAP、Survivin蛋白的表达，二者合用可使XIAP、Survivin蛋白的表达明显降低。　　三、MicroRNA在山楂酸抑制A549细胞中的作用　　AFFX miRNA表达谱芯片检测山楂酸作用前后A549细胞中miRNA表达差异，筛选出山楂酸抑制A549细胞的靶miRNA，其中59个miRNA表达显著差异（大于10倍以上改变），23个miRNA表达上调，36个miRNA表达下调。生物信息学分析预测，由上述miRNA调控的细胞增殖相关靶蛋白400余个，细胞凋亡相关靶蛋白300余个，其中XIAP是miR-630下游调控的靶蛋白。　　结论:　　1、山楂酸可以抑制肺癌A549细胞的增殖，这种抑制作用具有浓度依赖性;山楂酸抑制肺癌A549细胞的增殖是通过诱导其凋亡来实现的，凋亡通路之一可能是线粒体凋亡通路。　　2、山楂酸、顺铂单独应用均对肺癌A549细胞有增殖抑制效应及诱导凋亡作用，二者合用有协同作用;山楂酸、顺铂单独应用均可下调凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin，二者合用可增强对凋亡抑制蛋白XIAP、Survivin的下调作用。　　3、59个miRNA参与了山楂酸对A549细胞的抑制作用，其中23个miRNA表达上调，36个miRNA表达下调。生物信息学分析预测，由上述miRNA调控的细胞增殖相关靶蛋白400余个，细胞凋亡相关靶蛋白300余个，其中XIAP是miR-630下游调控的靶蛋白。