脯氨酰内肽酶(EC3.4.21.26,prolyl endopeptidase,简称PEP),是一种新型丝氨酸蛋白酶S28家族水解酶,特异性的作用于多肽C末端的脯氨酸残基之间的肽键。脯氨酰内肽酶虽然广泛应用于生物医药、食品、酿造行业等,但是微生物来源少而且产量和酶活低下。本论文采用的是表型突变株黑曲霉SH-2,其具有强大的蛋白分泌表达能力,工业上用于表达同源或者异源蛋白的宿主。同时黑曲霉被认证为安全(GRAS)微生物具有完善和强大的蛋白翻译以及修饰,在表达同源或者异源蛋白时,具有安全、高产和高效的特点。本论文围绕着在黑曲霉宿主的改造和高效表达脯氨酰内肽酶进行研究。本论文采用同源重组和标记循环的方法敲除宿主菌的多拷贝内源性分泌蛋白基因如分泌淀粉酶,减少宿主细胞中内源性胞外分泌蛋白对表达目的蛋白的竞争作用。本论文完成了一拷贝酸性淀粉和两拷贝的中性淀粉酶的宿主菌构建,发酵上清液SDS-PAGE分析显示内源三条淀粉酶的蛋白条带消失,内源性分泌蛋白量大幅度下降。我们进一步构建一个终止子和标记基因循环使用的丝状真菌通用性表达质粒,并基于构建的内源分泌蛋白背景敲除宿主优化脯氨酰内肽酶的表达,研究两个不同强启动子如糖化酶启动子、杂合启动子下的脯氨酰内肽酶表达;将糖化酶启动子和杂合启动子控制下的脯氨酰内肽酶表达框同时整合到宿主染色体上。基于5L发酵罐的测试中第一个拷贝所得的产物的酶活达到6.89U/ml,相比实验室前期研究表达量高数倍。