酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸耐热,生存能力独特,可经受传统的巴氏杀菌而存活,是导致酸性果汁腐败变质的主要菌种,给果汁加工业造成了巨大的经济损失。如何有效控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染已成为食品研究领域和果汁产业普遍关注的问题。研究酸土脂环酸芽孢杆菌耐热机制有助于解决该菌在果汁加工业中的污染问题,对酸土脂环酸芽孢杆菌的危害控制具有重要意义。本文利用Label-free技术筛选酸土脂环酸芽孢杆菌在热胁迫下的差异表达蛋白并进行生物信息学分析,研究差异蛋白的分子功能及其参与的代谢途径,进而利用qRT-PCR从富集大量差异蛋白的主要通路中筛选响应热胁迫的关键蛋白;STITCH数据库预测耐热关键蛋白互作网络并构建酵母双杂交文库,为进一步筛选耐热关键调控蛋白奠定基础。研究结果揭示了关键蛋白在酸土脂环酸芽孢杆菌应答热胁迫过程中的分子功能及其与互作蛋白的关系和作用模式,阐明关键蛋白调控酸土脂环酸芽孢杆菌应答热胁迫的分子机制。主要研究结果如下:1、通过菌落计数法与环境扫描电镜检测,发现65℃处理5 min时,酸土脂环酸芽孢杆菌菌体数量变化不显著,菌体表面轻微损伤,推测在此处理条件下,该菌仍保持存活状态且胞内蛋白表达可能有显著变化。因此,选择65℃,5 min为热胁迫处理条件。2、65℃、5 min热处理条件下,在酸土脂环酸芽孢杆菌中共鉴定出545种差异表达蛋白,其中258种表达量上调,287种表达量下调,这些表达量显著变化的差异蛋白分别被映射到100条通路。与蛋白质、DNA、细胞壁成分等生物大分子保护和修复有关的蛋白的表达量有显著变化,表明这些蛋白可能在热应激过程中起关键作用。KEGG通路分析、蛋白质功能分析及mRNA水平的验证结果表明酸土脂环酸芽孢杆菌可能通过DNA和RNA分子的构象变化感知外界温度改变。菌体受到热应激时,抗生素合成通路和核糖体通路可能参与了信号转导,调节热应激相关蛋白的表达。3、通过STITCH数据库搜索耐热关键蛋白的靶点信息,除去重复信息,共筛选得到靶点37个。通过蛋白互作网络构建,并进行模块分析和功能注释,发现其主要参与的生物过程大多与压力应激响应相关,进一步验证了qRT-PCR的结论。与DnaK互作的靶点蛋白种类最多,主要是热休克蛋白和DNA修复蛋白,通过蛋白互作网络模块分析得到DnaK参与了热应激响应及核酸代谢,与蛋白组学结果一致,因此,拟选择DnaK作为酵母双杂交的诱饵蛋白。4、以mRNA为模板,采用SMART技术合成cDNA第一链,并利用LD PCR技术合成双链cDNA,DSN均一化处理cDNA并去除短片段,纯化后与载体pGADT7共转化至大肠杆菌感受态细胞构建均一化酵母双杂交cDNA文库。经检测,文库库容大于1×10~6 CFU,平均插入片段大于900 bp,阳性率≥95%,文库质量高,指标合格,可用于进一步的酵母双杂交文库筛选。研究结果从蛋白水平上全面揭示酸土脂环酸芽孢杆菌耐热生理适应机制,为食品保藏、微生物抗逆特性研究及抗高温高酸的特殊工业菌研发等提供理论和实验依据。