在多种生物中，外源双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)导入细胞中，与dsRNA同源的mRNA受到降解，其相应基因受到抑制，称为RNA干涉(RNA interference，RNAi)。这种属于RNA水平上的基因抑制，可能是生物普遍存在的RNA水平上调节基因表达的方式，同时也提供了一种特异性失活功能基因的方法。新近发现，体外合成dsRNA可直接触发RNAi，这些小分子dsRNA被称为小干涉RNA(small interfering RNA)或短干涉RNA(short interfering RNA)，即siRNA。多项实验证明，siRNA具有强大、特异的基因抑制功能，对于体外转导的基因和细胞的内生基因同样有效。尤其是在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面，既可以特异性抑制、降解同源mRNA序列，有效阻止相应蛋白质的表达，又可避免长链dsRNA引起的非特异性基因降解和细胞死亡。其优点在于：靶序列的识别过程是高度特异的；触发RNAi所需的有效浓度并不高，并可以在RNAi作用中循环产生；能抵抗核酸酶的消化作用。与相应的单链反义寡核苷酸相比，体外合成siRNA造成的基因抑制效率更高、特异性更好，所需有效浓度大大减低。体外合成的siRNA通常由两条互补的核苷酸单链组成，每条单链为21～25 nts，具有5′磷酸基、3′羟基的结构，每个3′端都具有突出的2个碱基。 多药耐药(multi-drug resistance，MDR)造成是白血病化疗失败主要原因之一。与MDR相关的基因和蛋白有多种，肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein，LRP)是其中之一，它的主要功能是导致细胞内、尤其是细胞核内药物聚集缺陷，因而与多种肿瘤细胞MDR有重要相关性。在白血病细胞中，其表达直接影响着患者化疗的预后，是造成白血病MDR的重要机制之一：在成人急性髓性白血病和儿童白血病中，LRP表达是独立的预后决定因素之一，其过度表达造成患者对化疗不敏感，致使完全缓解率低，完全缓解所需时间长，易复发；难治性或复发性的白血病细胞LRP的过度表达比未经过化疗或化疗敏感的白血病细胞更常见。由于LRP的耐药机制属非ATP依赖性，通常用于逆转P蛋白MDR的药物如维拉帕米、环孢素等对其没有逆转作用。 因此，采用siRNA介导的RNAi技术，阻断L即在白血病细胞中的过度表达，有望能消除LRP的作用，为逆转其引起的MDR的基因治疗提供理论基础，开创一条新的途径。 本研究内容包括: ①采用丁酸钠(sodi切叮bu如献e，NaB)诱导K562细胞系，建立K562细胞高表达LR卫的细胞模型。K562细胞经2 nnno比NaB处理后，LR卫mRNA水平显著增高;LRP蛋白表达由阴性转为阳性，LR卫阳性细胞百分率为36%;细胞内柔红霉素(山鱿morUbicin，DNR)蓄积减少了68.70%，阿霉素(adri田皿ycin，ADM)细胞核分布减少，细胞浆分布增加。 ②由克隆载体中扩增出LRP全长cDNA，采用粘端连接法，将其克隆入真核表达载体peDNA3的B别盯Hl和Hindlll酶切位点，成功构建了LR卫真核表达载体PcDNA3几Rp。测序结果显示基因序列正确，转染K562细胞能表达LRP基因和蛋白。 ③按照siRNA的设计原则自行设计LR卫特异性siRNA(siRNA-LRP)，Blast同源分析未见其靶InRNA与其它基因m丑NA有完全互补的碱基序列，计算机辅助分析显示该序列适合RNAi作用。 ④采用脂质体转染的方法，用LRP特异性siRNA与LRP真核表达载体pcDNA3/LR卫共同转染K562细胞，检测siRNA一LRP对LRp基因和蛋白表达抑制作用的有效性;用siRNA一LRP对绿色荧光蛋白质粒pEGFP一c1(表达的影响，检测siRNA一LRP对LRP抑制作用的特异性。结果显示siRNA.LR卫能有效且特异性地在转录后水平抑制K562细胞外源LR卫基因的表达。 ⑤采用脂质体转染的方法，用siRNA一LRP转染上述由NaB诱导K562细胞高表达LRP的细胞模型，转染前后结果比较发现，转染后K562细胞中LRPm丑NA被降解，LRP蛋白表达明显抑制，LRP的作用被消除，即细胞内DNR蓄积增加，细胞核内ADM增多，胞浆内ADM减少，恢复到未经处理的K562细胞的水平。 ⑥分别以脂质体包裹siRNA一LRP和空脂质体转染K562细胞，台盼兰染色检测细胞死亡率，MTT法检测细胞增殖情况，结果显示二者的一2一细胞死亡率、细胞增殖无显著差异，表明siRNA一LRP转染K562细胞，既未引起大量细胞非特异性死亡，亦不影响细胞增殖。 上述实验结果表明，NaB能诱导K562细胞LRP mRNA水平和蛋白表达增高，LRP表现出减少药物在细胞内蓄积、改变药物核一浆分布、减少药物在细胞核内分布的作用;自行设计的LRP特异性s1RNA能有效、特异地降解LRP mRNA、抑制LRP蛋白表达，进而消除其作用，为进一步开展逆转LRP介导的白血病细胞MDR的基因治疗奠定了实验基础。