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研究背景儿童恶性肿瘤现已成为危害儿童生命的常见疾病。与成人恶性肿瘤一样,目前对儿童恶性肿瘤的治疗多采用手术、化疗、放疗三大传统治疗。由于儿童的药代动力学和药效动力学不同于成人,常用的放化疗措施均伴随着明确的近、远期毒副作用,影响患者的生长发育及长期生存者的生活质量,且伴有转移率和复发率高的风险。因此,亟需一种高效、安全的治疗儿童恶性肿瘤的方法。基于树突状细胞(dendritic cells,DCs)的免疫治疗正逐渐成为治疗肿瘤患者的重要方法之一。正常情况下,DC以不成熟的形式存在。未成熟的DC激活T淋巴细胞的能力较弱,只有成熟的DC能刺激初始T淋巴细胞,使T细胞活化,刺激机体免疫应答。如何大量高效率制备体外诱导的DC,并增强DC诱导的抗肿瘤免疫能力,已成为研究DC疫苗的重点和难点问题。机体针对自身肿瘤相关抗原的免疫杀伤受到内源性抑制机制的制约,常导致杀伤效力减低,对许多肿瘤的免疫治疗因此难以取得预期效果。近年研究发现,细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS1)是存在于DC内调节T细胞激活能力及获得性免疫的内源性抑制分子。SOCS1可抑制T细胞及其它免疫细胞内的JAK活性,对多种细胞因子(如IFN-γ等)的信号转导均起抑制作用,是调节DC抗原提呈以及获得性免疫幅度的关键分子之一。在DC内抑制SOCS1的表达是否可增强DC诱导的特异性杀伤儿童恶性肿瘤细胞的能力,迄今鲜有报道。因此,本研究的目的是:1)探索从外周血单核细胞(PBMC)获取大量成熟DC的可行性及刺激DC成熟的策略。2)观察负载全肿瘤抗原的DC刺激T细胞对其增殖及杀伤自体及异体实体瘤鼻咽瘤细胞能力的影响。3)探讨用siRNA技术沉默SOCS1表达,观察其对DC抗肿瘤免疫能力的作用,为提高DC临床免疫治疗儿童非实体瘤白血病的疗效提供实验基础和理论依据。实验方法1)肿瘤细胞培养:活检组织采用组织块法培养。CNE-2Z及K562细胞按常规方法培养。2)全肿瘤抗原制备:采用反复冻融法,并用60Coγ射线照射(剂量25Gy)。3) DC的体外诱导及扩增:采用PBMC分离法,加入细胞因子GM-CSF、IL-4培养,培养第3天加入全肿瘤抗原、第7天加入TNF-α刺激DC成熟。4) DC形态学鉴定:分别采用倒置显微镜、扫描电镜和投射电镜。5) DC表面抗原及成熟度检测:采用流式细胞仪法。6)肿瘤DC刺激T细胞增殖能力检测:采用四氮唑蓝试验(MTT法)。7)肿瘤DC活化的CTL体外杀伤活性检测:采用MTT法。8)肿瘤DC活化的CTL分泌IFN-γ能力检测:采用ELISPOT实验。9) DC内SOCS1的表达:分别用RT-PCR和Western blot测定其mRNA和蛋白表达。实验结果1) DC形态学鉴定:倒置显微镜及电镜下可见细胞表面典型的树突样突起。2)培养5天负载全肿瘤抗原的DC(未成熟DC),其细胞表面标志性分子HLA-DR、CD1a、CD80、CD83和CD86经流式细胞检测阳性率分别为:(60.86±5.42)%、(21.84±2.52)%、(5.49±6.32)%、(6.82±1.24)%和(1.24±0.90)%,而经过TNF-α刺激的负载全肿瘤抗原的DC(成熟DC),上述细胞表面分子的阳性率分别为(86.14±8.32)%、(78.28±11.42)%、(78.24±12.64)%、(67.25±14.24)%和(85.26±9.14)%,各表面分子的表达明显高于未成熟DC(P < 0.01~0.05)。3)随着DC:T细胞比例由1:100增至1:5,各组T细胞增殖的刺激指数均呈增加趋势。负载全肿瘤抗原的DC刺激T细胞增殖的刺激指数高于未负载全肿瘤抗原的DC。4)经过负载全肿瘤抗原的DC活化的CTL对自体或异体鼻咽癌细胞均具有杀伤活性,其对鼻咽癌细胞的杀伤率与效靶比成正比。5)用负载全肿瘤抗原的DC孵育的T细胞中分泌IFN-γ的细胞数目显著多于未负载全肿瘤抗原的DC组和单独T细胞组(P﹤0.05)。6)在培养第7天加入TNF-α(1000 U/mL)刺激DC成熟后,K562-DC中SOCS1 mRNA和蛋白表达增加。经SOCS1 siRNA(SOCS1 siRNA1和siRNA2)转染成熟DC 24 h可明显降低K562-DC中SOCS1 mRNA及蛋白的表达。7)培养5天负载全肿瘤抗原的DC(未成熟DC),其细胞表面标志性分子HLA-DR,CD1a、CD80、CD86和CD83经流式细胞检测阳性率分别为:(54.65±3.28)%、(17.42±6.78)%、(6.27±5.29)%、(3.02±2.47)%和(3.28±2.79)%,而用TNF-α诱导K562-DC成熟,各表面分子的阳性率分别为(69.52±8.68)%、(58.97±4.25)%、(63.84±7.32)%、(72.69±6.23)%和(71.46±4.96)%,均显著高于未成熟DC(P < 0.01~0.05)。经SOCS1 siRNA转染成熟DC 24 h后,上述分子的阳性率分别为(67.17±9.53)%、(59.46±5.17)%、(65.72±6.58)%、(71.47±5.68)%和(87.92±3.94)%。其中CD83的阳性率显著高于未转染DC组(P < 0.05)。8) TNF-α刺激成熟的K562-DCs其刺激T细胞增殖的能力明显高于未成熟DC,且随着DC: T细胞比例的增加,刺激能力增强,以效靶比1: 5时刺激作用最为显著(效靶比1:20及1:5时均有P < 0.01)。SOCS1 siRNA转染后K562-DCs刺激T细胞增殖的能力较之scramble siRNA后的K562-DCs强,二者比较有显著性差异(P < 0.05)。9)经TNF-α刺激成熟的K562-DCs其刺激外周血T细胞对K562细胞的杀伤率明显增加,在效靶比为5~20:1时杀伤率增加尤为明显(成熟DC vs.未成熟DC, P < 0.01)。采用SOCS1 siRNA转染的K562-DCs刺激外周血T细胞可使T细胞对K562细胞的杀伤率进一步增加(P < 0.05),其对K562细胞的杀伤率的影响强度与效靶比成正比。10)成熟的K562-DCs刺激后,外周血T细胞分泌IFN-γ的数目增加(成熟DC vs.未成熟DC,P < 0.01)。而采用SOCS1 siRNA转染的K562-DCs刺激外周血T细胞可进一步增加IFN-γ的T细胞数目(P < 0.05)。结论1)从PBMC来源的、负载全肿瘤抗原的DC经细胞因子诱导成熟后,可刺激T细胞增殖,并增强其特异性杀伤肿瘤细胞的能力。2) SOCS1 siRNA转染可有效抑制DC内SOCS1表达,可突破内源性抑制机制的制约,使成熟DC诱导出更强的反应,表现为T细胞增殖反应增加及其对K562细胞的杀伤能力增强。综上所述,我们的结果提示,负载全肿瘤抗原的DC可能是治疗儿童恶性肿瘤的一种有效方法,具有潜在的临床应用价值。而采用SOCS1 siRNA抑制SOCS1,增强CTL对肿瘤细胞的杀伤效应,可能是一种增强获得性免疫的重要策略。