肌内脂肪含量是影响猪肉品质的一个关键指标,不仅影响猪肉的色泽、风味和嫩度,同时对猪肉的保水力也有重要影响,我国地方优良地方品种猪金华猪肌内脂肪含量高、肉色红润,与外来品种长白猪相比,表现出优良的肉品质性状。因此,本研究以金华猪和长白猪为试验动物模型,在比较两品种猪胴体性状及肉质差异的基础上,通过基因芯片技术、生物信息学分析技术获得金华猪和长白猪背最长肌基因差异表达谱,并通过半定量和实时荧光定量验证基因芯片数据的可靠性。进一步通过RACE克隆技术克隆得到调控猪肌内脂肪沉积的新基因pFLJ的cDNA全长,并利用RNAi技术和基因超表达技术在转录水平上初步鉴定pFLJ基因调控猪肌内脂肪沉积的内在机制。主要的研究结果如下：实验一金华猪和长白猪胴体性状及肉质的比较研究分别选取胎次相同、体重均一的纯种金华猪和纯种长白猪在同一饲养条件下饲喂相同营养水平的日粮,分别在30、60、90、120、150日龄时进行屠宰测定及背最长肌样品采集。1)胴体性状研究结果表明,从30到150日龄,金华猪增重约40kg,而长白猪增重70kg,这表明金华猪生长速度明显低于长白猪。与长白猪相比,金华猪瘦肉率在30、60、90、120、150日龄均显著低于长白猪(p<0.05),眼肌面积呈现相同趋势；脂肪率在30、60、90、120、150日龄均显著高于长白猪(p<0.05),150日龄时,金华猪脂肪率达32.4%,比长白猪(13.3%)高2.4倍以上(p<0.05),背膘厚品种差异与脂肪率呈现相同趋势,并且150日龄时金华猪背膘厚(23.7mm)是长白猪(12mm)的2倍以上。2)肉品质性状结果表明,金华猪肌内脂肪含量均高于长白猪,90日龄后出现显著高于长白猪(p<0.05),并且金华猪在60(1.48%)、90(2.25%),120(3.20%)和150(3.38%)日龄阶段肌内脂肪含量呈现稳定增加趋势,长白猪中肌内脂肪含量在60(1.13%)、90(1.28%)、120(1.31%)和150(1.79%)日龄阶段呈现稳步增加趋势,而从30日龄到150日龄阶段相对金华猪肌内脂肪含量增加幅度较小,提示金华猪拥有更优于长白猪的肌内脂肪沉积能力；与长白猪相比,金华猪滴水损失低于长白猪,肉色L*值高于长白猪；以上结果进一步揭示所选模型金华猪虽然生长速度慢,但肉质较长白猪更为优良,且在90日龄后金华猪肌内脂肪含量显著高于长白猪,因此本实验为实验二的开展肉质内在调控基因的挖掘提供了基础数据及实验动物样品。实验二金华猪和长白猪背最长肌基因表达谱差异研究利用基因芯片技术、生物信息学分析技术研究了实验一所采集的30、90、150日龄金华猪和长白猪背最长肌的基因表达差异。1)不同日龄阶段基因表达谱差异研究结果显示,与30日龄相比,90日龄金华猪背最长肌显著高表达基因有177个,显著低表达的基因有242个,150日龄金华猪背最长肌显著高表达基因有101个,显著低表达的基因有389个；与30日龄相比,90日龄长白猪背最长肌显著高表达基因有106个,显著低表达的基因有231个,150日龄长白猪背最长肌显著高表达基因有93个,显著低表达的基因有383个；2)两品种猪背最长肌中基因表达差异分析结果显示,与长白猪相比,30日龄金华猪背最长肌中显著高表达基因有176个,显著低表达基因有199个,90日龄金华猪背最长肌中显著高表达基因有276个,显著低表达基因有155个,150日龄金华猪背最长肌中显著高表达基因有525个,显著低表达基因有670个。3)两品种猪背最长肌中基因表达规律类似度比较结果显示,与30日龄相比,90日龄中金华猪和长白猪均高表达和低表达的基因的类似度分别为0.7%和1.7%；150日龄中金华猪和长白猪均高表达和低表达的基因的类似度分别为3.2%和7.9%,该研究结果揭示金华猪和长白猪在相同日龄条件下,肌纤维生长和发育及肌内脂肪沉积的内在机制存在显著差异。将上述获得的差异表达基因进行生物信息学分析,结果显示,金华猪与长白猪背最长肌中差异表达基因主要有肌纤维生成与发育相关基因或转录因子、脂肪代谢相关基因和转录因子。提示肌纤维生成和发育以及脂肪代谢相关基因或转录因子可能是调控两品种猪肌内脂肪沉积差异的关键因素。进一步通过实时荧光定量和半定量PCR法双重验证了基因芯片数据的可靠性,结果显示,实时荧光定量PCR、半定量PCR结果均与基因芯片结果相一致,提示通过本实验所获得的芯片结果可靠性强；综上所述,高通量的差异基因的获得为后续研究猪肌内脂肪沉积内在分子机制提供科学可靠的基础数据。实验三猪肌内脂肪沉积关键新功能基因pFLJ的筛选、cDNA全长克隆及序列分析根据上述通过基因芯片技术获得的差异基因列表,基因芯片数据结果显示,EST序列编号为BI184304的基因在90日龄时,其表达水平金华猪显著高于长白猪,倍数高达9倍以上,且在皮下脂肪组织中两猪种差异不显著,实时荧光定量研究结果与芯片研究结果相一致。进一步利用实时荧光定量法研究了其在金华猪中的组织特异性,结果显示其在肌肉中表达最高,在脑组织中次之；不同生长阶段金华猪背最长肌中EST序列编号为BI184304的基因表达规律结果显示,伴随着肌内脂肪沉积的增加呈现上升趋势,且与金华猪肌内脂肪在90日龄出现显著高于长白猪的趋势一致。推测,EST序列编号为BI184304的基因可能是参与猪肌内脂肪调控的关键基因。因此,将其作为后续研究猪肌内脂肪沉积的候选基因。为研究上述筛选获得的候选基因功能,根据已知的EST序列,通过RACE技术,克隆得到EST序列编号为BI184304的基因全长cDNA序列,基因全长cDNA序列有2793bp,其中包括283bp5’非编码区(5’-untranslated region,5’-UTRs)、714bp编码区(coding region, CDs)和1796bp的3’非编码区(3’-UTR),编码区翻译237个氨基酸；BLAST结果表明,氨基酸序列序列与人、鼠FLJ基因同源性分别达到99%,84%,因此将此基因命名为猪FLJ基因即为porcine FLJ (pFLJ)。pFLJ基因cDNA全长基因的克隆为后续研究pFLJ基因的功能奠定分子生物学基础。实验四pFLJ对肌内脂肪沉积的影响及调控机制研究为研究pFLJ基因的功能,本实验通过差速贴壁法建立了猪肌内脂肪细胞体外培养模型,以此肌内脂肪细胞培养模型为实验对象开展研究,主要实验结果如下：为初步探索pFLJ基因的功能,本实验首先研究了猪肌内脂肪细胞不同分化阶段的脂滴沉积规律、pFLJ基因及脂肪分解关键基因ATGL和HSL基因的表达规律,研究结果表明：猪肌内脂肪细胞中,FLJ的基因表达随着细胞的分化而在第4d后逐渐升高,与脂肪分解关键基因ATGL和HSL基因逐渐降低这一规律呈相反趋势,与脂滴沉积增加规律呈显著正相关；其次利用本课题组已有的经典脂肪沉积抑制剂SR141716处理猪肌内脂肪细胞,研究结果发现,随着SR141716添加浓度的增加,与对照组相比,pFLJ基因表达显著降低；进一步利用能显著提高肌内脂肪沉积、改善肉质的营养因素CLA处理猪肌内脂肪细胞,结果发现,随着CLA添加浓度的增加,与对照组相比,pFLJ基因mRNA水平显著提高(p<0.05),同时能显著提高脂肪合成关键酶FAS基因mRNA水平,同时增加了猪肌内脂肪细胞中甘油三酯的含量(p<0.05)。因此,综合前述金华猪和长白猪品种比较和表达规律研究结果,推测FLJ基因可能是正调控肌内脂肪沉积的关键功能基因。为证明上述推论,首先通过RNAi技术,筛选获得了FLJ基因的有效siRNA表达载体fs1,经干扰条件优化后的干扰效果达到70.9%。转染fs1干扰FLJ基因表达后,显著降低了脂肪合成关键基因FAS和ACC基因的表达(p<0.05),但同时也显著降低了脂肪分解关键基因ATGL和HSL基因的表达(p<0.05),降低了培养基中甘油的含量。进一步的CLA与干扰FLJ基因表达协同作用结果表明,与CLA添加实验组相比,CLA与干扰FLJ基因表达协同作用实验组的猪肌内脂肪细胞中脂肪合成关键基因FAS显著降低(p<0.05),脂肪细胞中的脂滴沉积也显著降低(p<0.05)。以上研究提示,抑制FLJ基因表达后,不仅降低了脂肪合成代谢关键功能基因表达(p<0.05),同时也降低了脂肪分解代谢关键功能基因表达(p<0.05),同时,干扰pFLJ基因的表达抑制了外源性脂肪酸对肌内脂肪细胞中脂滴的沉积的正调控作用。提示,pFLJ基因可能是参与外源脂肪酸调控肌内脂肪细胞中脂滴沉积的关键基因。为进一步验证上述推论,本实验构建了猪FLJ基因的荧光超表达载体,经超表达条件优化后转染pEGFP-FLJ超表达FLJ基因表达后,升高了脂肪合成关键基因FAS和ACC基因和脂肪分解关键基因ATGL和HSL基因的表达,与前述干扰实验结果相一致。CLA与pEGFP-FLJ超表达FLJ基因协同作用结果显示,与CLA处理组相比,CLA和超表达FLJ基因协同处理肌内脂肪细胞,极显著增加了脂肪合成代谢关键功能基因FAS基因的表达(p<0.01),对脂肪分解关键功能基因ATGL等表达有升高趋势,同时显著增加了脂肪细胞中甘油三酯的沉积(p<0.05),降低了培养基中甘油的含量。上述pFLJ超表达结果进一步揭示,超表达pFLJ基因后,不仅降低了脂肪合成代谢关键功能基因表达,同时也降低了脂肪分解代谢关键功能基因表达,同时,超表达pFLJ基因能够显著有效地增强外源性脂肪酸对肌内脂肪细胞中脂滴沉积的正调控作用。综上所述,本研究在比较金华猪和长白猪肉品质的基础上,获得了金华猪和长白猪30、90、150日龄背最长肌中基因转录表达谱,所筛选获得的差异表达基因为后续通过营养或基因手段调控肌内脂肪沉积提供重要的理论依据,在此数据基础上,筛选并克隆获得了猪肌内脂肪沉积关键新功能基因pFLJ基因,初步揭示猪FLJ基因可通过正调控脂肪代谢关键功能基因的表达,提高整体脂肪代谢的速率,进而提高肌内脂肪的沉积,在此过程中,FLJ基因可能是调控脂肪酸转运至细胞进行本地脂肪沉积的关键基因。