背景和目的：原发性肝细胞癌(HCC)是我国最常见的肝脏肿瘤之一,约占原发性肝癌的90%,因其发现晚、进展快,死亡率排名全球第三。虽然大部分肝癌风险因素诸如：乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染、既往存在肝纤维化、酗酒、大量摄入黄曲霉素B1污染的食品已等被人们熟知,但是肝癌的分子机制并不是十分明确。目前认为HCC的发生和发展是一个包含癌基因激活及抑癌基因失活的多步复杂过程。本实验室既往选取25对肝癌组织和配对癌旁组织的DNA样本,通过2-Mb比较基因组杂交(Array Comparative Genomic Hybridization,aCGH)发现癌组织中Protocadherin9基因(PCDH9,13q21.32)在24%(6/25)的患者中存在缺失,在1例患者的肿瘤组织检测到扩增。钙粘蛋白超家族是由一些跨膜或膜相关糖蛋白组成的一个大家族,它在调节胚胎发育中组织和器官的形成、稳定细胞-细胞连接形成及维护成熟器官的正常组织结构中发挥了至关重要的作用。在过去的十年中,有一些钙粘素家族成员,包括PCDH8、PCDH10、PCDH17和PCDH20被报道为肿瘤抑癌基因。PCDH9属于protocadherin81家族成员,主要表达于神经系统。PCDH9位于染色体13q21.32区域,能编码一个大小为137KD的蛋白。13q染色体区域上等位基因的缺失是HCC和其他肿瘤中最常见的遗传改变之一,提示13q区域包含很多可能的肿瘤抑癌基因。最近的研究已经表明,PCDH9在非套细胞淋巴瘤和成胶质细胞瘤中表达是下调的,并且PCDH9低表达和病人预后差有关,这表明PCDH9可能是潜在的抑癌基因。PCDH9在肿瘤的发生和发展中的作用尚未明确,它的功能和细胞内信号传导在很大程度上是未知的,特别是在肝细胞癌中。因此,我们在HCC细胞系及组织中检测PCDH9的表达,分析其表观遗传学改变、生物学效应、在肝癌发生发展中的作用以及在肝癌预后的意义。材料和方法：入选标本信息：标本取自于河南省肿瘤医院2009年至2013年原发性肝细胞癌患者手术所得120例肝癌组织标本及配对癌旁组织标本,所有标本经手术切除后于液氮中保存。所有标本经该院病理科确诊,符合原发性肝癌诊断标准。患者年龄11-80岁,平均年龄为53.4±11.0岁；男性：女性=77：43。所有病例均为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性。8例肝癌细胞系Huh-7、SK-HEP-1、SMMC-7721、PLC/PRF/5、SNU-449、 SNU-387、Hep3B和SNU-182冻存于北京大学医学部病原微生物系液氮罐中。培养于含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培养基中,置于37℃,含5%CO2的培养箱中培养。使用实时荧光定量、western blot及免疫组化检测PCDH9在肝癌细胞系及肝癌组织和配对癌旁组织中的表达。启动子区甲基化状态使用甲基化敏感酶和甲基化依赖酶酶切联合qPCR定量分析方法来分析。PCDH9的生物学功能通过构建肝癌细胞系过表达或敲减PCDH9基因的稳转细胞系,MTT实验、流式细胞周期测定、集落形成实验、软琼脂集落形成实验及裸鼠成瘤实验等研究其对细胞增殖、细胞周期、非锚着依赖性生长及裸鼠成瘤能力的影响。通过TOP-FLASH荧光素酶报告基因检测PCDH9对Wnt通路的影响。通过缺失CM2、CM3的PCDH9载体后行集落形成实验探究CM2、CM3区对PCDH9功能影响。经过磁珠聚集实验和CO-IP实验研究PCDH9与自身的同源粘附及与经典钙黏附素蛋白的异源粘附作用。形态学及实时荧光定量检测PCDH9过表达或敲减的细胞系中一系列EMT关键标志物表达水平的变化研究PCDH9与EMT通路的相关性。采用SPSS13.0软件,所有结果均表示为mean±SD。120例癌和配对癌旁组织进行配对t检验统计分析(two-tailed,P<0.05标记为显著差异)。对HCC患者的PCDH9表达情况或启动子甲基化状态与临床资料特征的相关性分析,采用chi-square检验,样本量<5时采用Fish检验。MTT实验采用析因设计资料的方差分析,两组间的均数比较使用独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,方差分析前进行方差齐性检验。裸鼠成瘤试验及划痕实验按重复测量数据进行方差分析。软琼脂集落形成、transwell实验采用独立样本T检验进行分析。结果：1.PCDH9基因在HCC细胞系及组织中表达下调实时荧光定量PCR检测PCDH9在肝癌细胞系中表达发现PCDH9在Huh-7, SMMC-7721,SK-HEP-1,SNU-182和SNU-449细胞中表达明显下调,在所检测的120对癌/癌旁组织中,PCDH9基因在61%(73/120)的癌组织中表达水平明显低于配对的癌旁组织,且具有统计学意义(P=0.032),这个趋势通过western blot免疫蛋白印迹及免疫组化实验在蛋白质水平再次得到验证。另外,PCDH9低表达和临床数据相关性分析中发现,PCDH9基因的低表达与患者门静脉癌栓的存在具有显著的相关性(65.8%vs.34.2%,P=0.019)。2.缺失和甲基化介导PCDH9的下调通过比较基因组杂交(aCGH)数据分析发现25例肝细胞癌患者的癌组织中有6例存在缺失,1例存在扩增。扩增3对组织外显子进行SNP位点检测时,发现组织中存在杂合性缺失。检测肝癌细胞系中PCDH9启动子甲基化状态时发现SMMC-7721细胞PCDH9启动子存在高甲基化(Hypermethylation>10%).且经去甲基化处理后,SMMC-7721细胞中低表达的PCDH9上调,而在未发生甲基化的细胞系中经去甲基化处理后PCDH9表达无明显改变,提示甲基化与PCDH9的低表达有关。此外,在约22%(24/111)的原发性肝癌患者,其癌组织中存在PCDH9启动子高甲基化,进而对PCDH9表达和甲基化关系分析时发现,高甲基化癌组织PCDH9的表达明显低于低甲基化组(P=0.035,)。并且组织中PCDH9启动子高甲基化和肿瘤体积增大(P=0.044,)、肝内播散增多(P=0.020,)相关。3.PCDH9能抑制肿瘤细胞增殖和裸鼠异体移植瘤形成将PCDH9表达质粒转染SUN449,或对Hep3B和PLC/PRF/5转染敲减细胞内源PCDH9的shRNA载体后,使用G418连续筛选四周,在筛选过程中我们发现,表达外源PCDH9的SNU-449细胞集落形成较对照组数量明显减少、体积更小。而在Hep3B和PLC/PRF/5中敲减内源PCDH9后,形成集落的数量较对照组显著多。对筛选出的集落进行PCDH9基因表达的实时荧光定量PCR的鉴定,同时使用western blot免疫蛋白印迹再次确认,成功筛选出PCDH9过表达的稳转细胞系(SNU-449)及PCDH9敲减的稳转细胞系(Hep3B和PLC/PRF/5)。将稳定过表达/敲减PCDH9的稳转细胞系行MTT细胞增殖实验发现,过表达PCDH9后SNU-449细胞生长显著慢于对照组,两组间细胞增殖能力差异显著(P<0.001)；而敲减细胞内源性PCDH9后,Hep3B和PLC/PRF/5细胞生长较对照组快(P<0.001)。流式周期测定发现过表达PCDH9的SNU-449细胞阻滞在G1期,但是并没有引起细胞凋亡,检测细胞周期相关蛋白发现p21wafl/cipl和p27蛋白等细胞周期负性调控因子的水平升高,而细胞周期素蛋白cyclin E的表达下降,提示PCDH9可能通过调节细胞周期蛋白来影响细胞增殖。软琼脂集落形成实验用以评估细胞的锚定非依赖生长能力,PCDH9过表达的SNU-449细胞中克隆形成比对照组数量明显减少、集落体积更小(P<0.001)。相反,在PCDH9敲减的Hep3B和PLC/PRF/5细胞中,软琼脂集落形成数量较对照组增多。进一步使用裸鼠进行体内实验评估PCDH9对肝癌细胞的致瘤性影响。我们发现在SNU-449细胞系中,注射肝癌细胞系4天后,PCDH9过表达组6只裸鼠有3只出现肉眼可见瘤体,而对照组6只裸鼠有5只出现肉眼可见瘤体。Hep3B细胞系中PCDH9敲减组中6只裸鼠有5只出现肉眼可见小瘤体,而对照组6只裸鼠有4只出现肉眼可见瘤体。PLC/PRF/5细胞系中PCDH9敲减组中6只裸鼠有5只出现肉眼可见瘤体,而对照组6只裸鼠有3只出现肉眼可见瘤体。更为明显的是,于注射5周后观察并收取瘤体,SNU-449细胞系中两组间皮下肿瘤生长之间具有显著差异(P<0.001),PCDH9过表达组瘤体体积(171.5±92.10mm3)较对照组小(545.8±131.9mm3)。Hep3B细胞系中PCDH9敲减组瘤体体积(372.7±49.8mm3)较对照组(220.3±60.8mm3)显著增大(P<0.001)。PLC/PRF/5细胞系中PCDH9敲减组瘤体体积(312.4±35.8mm3)较对照组(209.7±40.5mm3)显著增大(P<0.001)。这些数据提示PCDH9能抑制肝癌细胞增殖,并在体内外降低肿瘤细胞集落形成能力。4.PCDH9能抑制肝癌细胞系迁移能力对PCDH9启动子甲基化与患者临床特征的关联分析发现,甲基化介导的PCDH9低表达和肝癌组织中肝内播散密切相关,故而我们设计了划痕试验和transwell实验以进一步评估PCDH9对肝癌细胞系迁移能力的影响。在SNU-449稳转细胞系中,两组细胞之间(vector vs.外源PCDH9表达)具有显著差异(P<0.001),vector组两划痕线间距离显著短于PCDH9组,提示划痕两侧细胞向中心迁移较快。而PCDH9敲减的Hep3B和PLC/PRC/5细胞中细胞迁移能力显著高于对照组。在transwell实验中收集迁移至下室的细胞发现SNU-449稳转细胞系中过表达PCDH9组向下室迁移的细胞明显比对照组少。相反,敲减PCDH9的两个稳转细胞系中向下室迁移的细胞数量较对照组多,提示PCDH9确实能抑制细胞迁移。5.PCDH9能抑制肝癌细胞的上皮.间质转化且需通过激活激活GSK-3P在培养PCDH9过表达的稳转细胞SNU-449的过程中发现,PCDH9过表达细胞发生有间充质细胞向表皮细胞的形态变化,进而通过实时荧光定量PCR检测EMT通路相关标志发现,PCDH9过表达与对照细胞的间质细胞标志N-cadherin、Vimentin和Fibronectin基因表达下调,上皮细胞标志E-cadherin、 Occludin、Desmoplakin和Keratin18表达上调,且超过2倍以上。EMT相关转录因子Snail,也出现了表达的下调。并且这个趋势通过western blot免疫蛋白印迹实验进一步验证。Snail能抑制E-cadherin的表达,是细胞EMT转换的关键调控因子。实时荧光定量PCR检测发现,Snail在SNU-449细胞过表达PCDH9后下调。Snail是一个半衰期只有25分钟的蛋白,GSK-3β介导的磷酸化是其最主要的降解途径。通过免疫蛋白印迹实验发现,与对照组相比,在过表达PCDH9的SNU-449细胞系第九位丝氨酸(ser9)磷酸化的GSK-3β蛋白下调,提示GSK-3β处于激活状态,据此我们推测,PCDH9的表达以某种方式使SNU-449细胞的GSK-3β激活,进而引起Snail的下调并抑制EMT,为证实这一推测,我们加用LiCl来抑制GSK-3β活性,我们发现,用3K-3p抑制剂LiCl处理后,过表达PCDH9的SNU-449细胞中其Snail的表达恢复了,同时N-cadherin升高,E-cadherin表达下降。实时荧光定量PCR检测进一步发现此时MET相关标志物发现上皮细胞标志上调、间质细胞标志下调的趋势消失。提示在这个抑制EMT过程中GSK-3p是必须的。我们进而发现,能使GSK-3β第九位丝氨酸磷酸化并抑制该酶活性的Erks和Akt激酶活性在过表达PCDH9后也出现了下降,提示PCDH9可能以目前未知的方式导致Erks和／或Akt的失活,进而导致了GSK-3p的去磷酸化活化。这些结果在敲减PCDH9的稳转细胞系中进一步得到验证。在敲减PCDH9的Hep3B和PLC/PRF/5细胞中的实时荧光定量PCR均显示,与对照组相比敲减PCDH9组的间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin、Snail和Fibronectin基因表达上调,上皮细胞标志E-cadherin、Occludin、Desmoplakin和Keratin18表达下调。在敲减PCDH9细胞系中也观察到Erk和Akt激酶活性较对照组升高,第九位丝氨酸磷酸化的GSK-3β也升高了,提示GSK-3β处于抑制状态。结论：PCDH9可能在肝细胞癌中作为一个新的抑癌基因。PCDH9可能可以通过抑制Erk和／或Akt活性来激活GSK-3β导致Snail下调从而抑制EMT。基因缺失和表观遗传学改变介导的PCDH9下调在肝癌患者具有一定的临床意义。