目的：　　 多形性胶质母细胞瘤(gdio blastoma multiforme,GBM)是最常见的恶性程度最高的颅内原发性肿瘤,虽采用各种手段综合治疗,但疗效仍不理想。肿瘤干细胞(cancerstemcells,CSCs)是指存在于肿瘤当中具有干细胞特性的一组细胞集群,在肿瘤发生增殖过程中起关键作用。本研究拟在已成功分离鉴定GBM的CSCs及对增殖相关因子DNA拓扑异构酶-Ⅱα(Topoisomerase-Ⅱα,Topo-Ⅱα)与GBM增殖关系研究的前期工作基础上,分离GBM的CSCs与非肿瘤干细胞(non-cancerstemcells,non-CSCs)两种细胞,进行体外培养;应用Westernblot及Real-timePCR等分子生物学手段研究Topo-Ⅱα的表达差异;应用RNA干扰技术沉默Topo-Ⅱα的表达,研究Topo-Ⅱα对CSCs增殖、凋亡等生物学特性的影响;进一步应用Topo-Ⅱα抑制剂进行干预,研究细胞增殖及细胞凋亡信号传导通路的变化,明确Topo-Ⅱα及其抑制剂对CSCs在肿瘤增殖过程中作用的影响及机制。本项研究不仅能在分子水平上阐明GBM的发病机理,还将为GBM的治疗提供重要的理论和实验依据。　　 方法：　　 选购人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞系模型进行体外培养,应用含生长因子的干细胞培养基培养约1-2周,分离和鉴定其中的CSCs及non-CSCs;应用Westernblot及Real-timePCR法检测CSCs及non-CSCs中Topo-Ⅱα的表达差异;设计并合成了Topo-Ⅱα基因特异性的siRNA并转染U87MG细胞的CSCs,检测Topo-Ⅱα表达沉默对CSCs的增殖能力、凋亡情况和细胞周期等生物学性状的影响,进一步了解Topo-Ⅱα在脑胶质瘤发生机制中的作用。　　 应用不同类型的Topo-Ⅱα抑制剂HU-331及阿霉素(doxorubicin,Dox)干预U87MG细胞的CSCs及non-CSCs生长,应用MTT法及流式细胞仪观察细胞增殖情况和细胞凋亡情况;进一步应用Westernblot法检测Topo-Ⅱα抑制剂对CSCs增殖及细胞凋亡信号传导通路相关因子(p38MAPK及caspase-3)表达的影响,明确Topo-Ⅱα及其抑制剂对CSCs在肿瘤增殖过程中的作用及影响机制。　　 结果：　　 1、人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞系的培养及CSCs的分离与鉴定　　 体外培养U87MG细胞系,并应用含有生长因子(EGF,bFGF)的无血清干细胞培养基培养1-2周,成功分离出细胞球细胞(neurospherecells,NCs),进一步通过CD133染色证实NCs阳性染色率明显高于非细胞球细胞(non-sphereformingcells,NSFCs);将NCs打散进行单细胞培养并诱导分化证实其具有多向分化能力;从而证实了NCs具有能分化成GBM并使之呈现细胞多样性的特点,具备CSCs的特性。　　 2、Topo-Ⅱα在CSCs和non-CSCs中的表达　　 应用Real-timePCR和Westernblot法验证Topo-Ⅱα在CSCs中的表达较non-CSCs中显著升高(P＜0.05)。　　 3、特异性siRNA合成及转染　　 成功地设计并合成了Topo-Ⅱα基因特异性的siRNA并转染CSCs,通过Real-timePCR和Westernblot验证得到了Topo-Ⅱα基因低表达的CSCs模型。结果发现转染siRNA-Topo-Ⅱα的细胞增殖能力显著降低(P＜0.05),细胞明显阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高(P＜0.05)。　　 4、Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox对CSCs及non-CSCs增殖的影响　　 应用Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox分别干预CSCs及non-CSCs,观察细胞的生长增殖情况,发现两组细胞都出现了生长停滞且细胞死亡的现象,但经MTT法验证CSCs组细胞增殖能力较non-CSCs组显著降低(P＜0.05);HU-331对CSCs和non-CSCs的作用强于Dox的作用,HU-331和Dox抑制CSCs增殖的作用强于对non-CSCs的作用。　　 5、Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox对CSCs及non-CSCs凋亡的影响　　 应用AnnexinV和PI双标法通过流式细胞仪分析Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox干预后的CSCs及non-CSCs的凋亡情况,并应用Westernblot法检测细胞凋亡蛋白caspase-3的表达,发现HU-331和Dox显著增加了CSCs和non-CSCs的凋亡率(P＜0.05)并显著上调caspase-3蛋白的表达(P＜0.05),HU-331的促凋亡作用强于Dox的作用;且HU-331和Dox促进CSCs凋亡的作用强于对non-CSCs的作用。　　 6、Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox对CSCs及non-CSCs中p-p38蛋白表达的影响　　 应用Westernblot法检测Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox干预后的CSCs及non-CSCs中p-p38蛋白的表达,发现HU-331和Dox显著上调了p-p38蛋白的表达(P＜0.05),HU-331上调p-p38蛋白表达的作用强于Dox的作用;且HU-331和Dox对CSCs的作用强于对non-CSCs的作用。　　 7、p38抑制剂SB203580与Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox联合应用对CSCs凋亡的影响　　 Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox单独以及分别与p38抑制剂SB203580联合作用于CSCs,应用Westernblot法检测细胞凋亡蛋白caspase-3的表达,并应用AnnexinV和PI双标法通过流式细胞仪分析细胞的凋亡情况,发现p38抑制剂SB203580能够显著下调caspase-3蛋白的表达和细胞凋亡率(P＜0.05),说明p38抑制剂SB203580显著抑制了HU-331和Dox对CSCs的促凋亡效应。　　 结论：　　 1、从人脑胶质母细胞瘤U87细胞系中分离出NCs,并经CD133特异性染色及细胞多向分化能力鉴定其具备CSCs特性。　　 2、Topo-Ⅱα在CSCs中的表达显著高于在non-CSCs中的表达。　　 3、设计并合成的特异性siRNA-Topo-Ⅱα,成功转染至U87MG细胞系CSCs,获得了Topo-Ⅱα基因低表达的CSCs模型。　　 4、RNA干扰Topo-Ⅱα降低CSCs的细胞增殖能力,影响细胞周期变化发挥促凋亡作用。　　 5、Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox能够显著抑制CSCs和non-CSCs的增殖并促进其凋亡,且HU-331的作用强于Dox的作用;HU-331和Dox对CSCs的作用强于对non-CSCs的作用。　　 6、Topo-Ⅱα抑制剂HU-331和Dox均能够通过p38MAPK介导的凋亡分子信号转导通路影响胶质瘤CSCs及non-CSCs的凋亡,且HU-331的作用强于Dox的作用。P38抑制剂SB203580显著抑制HU-331和Dox对CSCs的促凋亡效应。