论文部分内容阅读
高速逆流色谱技术(High-Speed Countercurrent Chromatography)是一项连续的液-液分配色谱技术,其具有无固相载体、样品无需严格预处理等优点,目前已经广泛应用于食品、天然产物、生物技术、医药、环境监测等领域。然而,现有的研究基本局限于采用高速逆流色谱的有机相-水相溶剂系统来分离纯化天然产物,在分离多糖、蛋白质、核酸的研究中因有机溶剂不能溶解生物大分子而受到限制。但随着近年来双水相体系的迅速发展,高速逆流色谱在研究分离多糖、蛋白质、核酸等生物大分子有其独特的优势。因此,本文主要从制备型高速逆流色谱技术与双水相溶剂体系分离纯化芦荟多糖方面进行研究,为分离纯化粗多糖提供一种新的方法。在国内,芦荟多糖的分离纯化比较传统、经典的方法大多是采用凝胶柱层析技术。该方法有方便,选择性大,对实验技能要求低等优点,但同时存在着机械化程度低、耗费时间长、制备量少等缺点。本研究将高速逆流色谱技术与凝胶柱层析技术结合进行对芦荟粗多糖的分离纯化,不但克服了耗时、机械化程度低、制备量少的特点,而且使高速逆流色谱在分离多糖方面进行了创新。芦荟有着很多重要医用药用价值,但其化学成分相当的复杂。目前,人们研究出的芦荟的生理活性主要都是针对多种组分共同作用的,通常起主要作用的只是其中的很重要的一类。要研究具体某一种活性物质的价值,就必须对该物质进行分离纯化。芦荟多糖是芦荟中最为重要的生物活性成分之一,具有提高免疫力、抗肿瘤、降血脂等生理功能。他们是医药及化妆品的天然原料,有着极其重要的研究利用价值。本文就是以此为目的,旨在研究运用高速逆流色谱与凝胶层析技术联合从库拉索芦荟凝胶中分离纯化芦荟多糖的方法,主要讨论了溶剂系统的组成、配比,及分配系数等用于高速逆流色谱分离的重要参数。其分离出的两个组分继续用凝胶层析技术进一步纯化,从而达到纯化为单一组分的目的,并研究其在小鼠活体实验中的降血脂作用。首先,通过采用基本方法对芦荟主要物质成份的测定可知,芦荟凝胶中含有98.74%的水分,总糖含量芦荟全叶要高于芦荟凝胶,为1.164%;芦荟全叶中蛋白质的含量主要在芦荟凝胶中,其外皮含量较少,芦荟凝胶中的灰分含量较低,仅为0.156%。其次,采用响应曲面法对芦荟多糖提取工艺参数的模型分析,超声波辅助提取库拉索芦荟凝胶中多糖的最佳工艺为:超声时间为45.85min,提取液pH值为8.74,液料比为29.84mL/g,对最佳工艺修正后得到的3次芦荟多糖平均提取率为11.332mg/g,采用蒽酮-浓硫酸法测得提取出的粗多糖含量为51.49%。再次,通过紫外-可见分光光度计法对高速逆流色谱仪分离芦荟多糖的溶剂系统进行研究,探索出分离芦荟多糖的溶剂系统为w(PEG600) : w(KH2PO4) : w(K2HPO4) : w (H2O) =5 : 15 : 15 : 65,加入的NaCl的质量分数为2%。采用此系统在转速为600r/min,固定相流速为8mL/min,流动相流速为2mL/min,进样量浓度为7.5mg/mL,水浴温度为30℃条件下,采用固定相-进样-流动相的进样顺序,成功分离出芦荟多糖的两个组分(APS-1、APS-2)。采用Sephadex G-150葡聚糖凝胶层析技术进一步对APS-1纯化,并考察了流速与进样量对分离效果的影响,通过不断改变条件成功分离出单一组分的多糖APS-1-1,经高效液相色谱技术检测其纯度高达98%,分子量为1300道尔顿。最后,通过对小鼠的高脂模型研究得出,芦荟多糖APS-1-1在降低肥胖小鼠体重的同时能起到较好的降血脂作用,其中对总胆固醇、甘油三酯的影响,多糖浓度在27mg/Kg为最佳,对低密度脂蛋白的影响,多糖浓度在9mg/Kg为最佳。