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肝细胞癌(HCC)是肝脏内发生的恶性肿瘤,是世界范围内的第五大常见恶性肿瘤,致死率在男性及女性中分列第二位及六位。据统计仅2012年全球就新增肝癌782,500例,而肝癌致死人数则高达745,500人,其中仅中国就占新发病例和死亡人数的50%左右。近年来随着计算机断层扫描(CT)和核磁共振成像(MRI)等技术应用于早期HCC的诊断以及外科手术、肝移植、经皮消融术、经动脉化疗等方式对HCC进行治疗,HCC患者的预后大为改善。但由于HCC的侵袭及转移HCC患者的死亡率高居不下。因此,寻找具有潜在治疗效果的新药及新的治疗靶点对HCC的治疗具有重要的意义。凝集素是一类能选择性地识别并可逆地与特定糖链结合的非免疫原性蛋白,可用于癌症发生发展过程中异常糖基化的检测,也可用于癌症的治疗。基于此,本论文以具有不同转移潜能的肝癌细胞为研究对象,运用凝集素芯片高通量筛选的特性筛选能与转移性肝癌细胞特异结合的凝集素,检测筛选所得凝集素对肝癌细胞生物学行为的影响,阐明其具体的作用机制。并对筛选所得凝集素的主要靶分子的糖基化修饰及功能进行了初步研究。主要的工作内容与相应的研究成果包括以下两个方面:1.凝集素BS-I通过AKT/GSK-3β/β-catenin通路抑制肝癌细胞迁移及侵袭通过细胞凝集素芯片筛选发现凝集素BS-I能与具有转移潜能的肝癌细胞结合;分别加入1 μg/mL BS-I和4 μg/mLBS-I处理MHCC97L和HCCLM3肝癌细胞能明显抑制细胞的迁移和侵袭;探讨BS-I作用机制发现BS-I能抑制Akt/GSK-3β/β-catenin通路活性,但不影响Integrin β1/FAK信号通路活性及Ras/Raf活性;加入GSK-3β的抑制剂CHIR99021和LiCl能逆转BS-I对肝癌细胞迁移和侵袭的抑制作用并能逆转BS-I对Akt/GSK-3β/β-catenin通路的抑制;通过单糖抑制实验发现BS-I通过Akt/GSK-3β/β-catenin通路抑制肝癌细胞迁移及侵袭作用的发挥依赖于BS-I与O-GalNAc的结合;通过质谱检测及免疫沉淀验证发现Grp78是一种能与凝集素BS-I结合的膜糖蛋白,BS-I抑制Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路的活性是通过下调细胞膜上Grp78的表达及Grp78-p85复合物的形成来实现的;接着我们通过瞬时转染Grp78和p85过表达质粒发现过表达Grp78或p85能逆转BS-I对肝癌细胞迁移和侵袭的抑制作用并能逆转BS-I对Akt/GSK-3β/β-catenin通路的抑制。以上结果表明凝集素BS-I具有抑制肝癌细胞的迁移及侵袭的能力,这一发现为研发治疗肝癌转移的药物提供了新思路。2.Grp78 637位点的O-GalNAc糖基化修饰影响其促进肝癌细胞的迁移及侵袭通过N-糖基化位点预测及PNGase F酶解实验发现细胞膜Grp78不存在N-糖基化修饰;通过SDS-PAGE分离回收细胞膜Grp78蛋白并用凝集素芯片检测发现细胞膜Grp78存在O-糖基化修饰并且其O-糖链中可能含有Gal、GalNAc、GlcNAc、Mannose和Sia结构;通过构建O-GalNAc糖基化位点突变质粒及凝集素免疫沉淀实验证实Grp78分子在637位丝氨酸上存在O-GalNAc糖基化位点;检测突变O-GalNAc糖基化位点对细胞行为的影响发现突变掉637位点的O-GalNAc糖基化修饰后Grp78分子促进细胞增殖、迁移及侵袭的作用消失,同时Grp78分子促进癌细胞EMT进程的作用也消失;探讨其机制发现Grp78分子的细胞膜分布依赖于其637位点的O-GalNAc糖基化修饰,突变掉637位点的O-GalNAc糖基化修饰阻断了 Grp78-p85复合物的形成,进而影响下游AKT/GSK3β/β-catenin通路的活化。以上结果表明Grp78 637位点的O-GalNAc糖基化修饰影响其功能的发挥,该结果为治疗肝癌转移提供了潜在的治疗靶点。