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三阴乳腺癌是乳腺癌中临床预后最差的一类亚型,由于缺乏特异性靶点,三阴乳腺癌患者对激素及抗体疗法均不敏感。过继细胞免疫疗法,尤其是嵌合抗原受体T淋巴细胞在血液系统恶性肿瘤治疗中的成功应用,为实体肿瘤的治疗提供了新的思路。但实体肿瘤存在肿瘤微环境所致的免疫抑制及CAR-T细胞靶向迁移率低等问题,这些问题限制了CAR-T疗法的临床疗效。传统CAR-T疗法为个体化方案,CAR-T细胞制剂的一致性差、制备周期长、成本高等瓶颈问题亟待解决。为增强CAR-T细胞向肿瘤组织内的靶向迁移,实现肿瘤微环境的人工调控,并探讨通用型CAR-T疗法的可行性,本研究第一部分实验中,通过在靶向叶酸α受体的嵌合抗原受体结构中引入趋化因子CCL19和正性细胞因子IL-7,实现了对T细胞具有更强活化功能并具有多种免疫细胞募集功能的新一代CAR结构设计。制备慢病毒载体并转染γδT细胞,实现通用型7x19FRα-CAR-γδT细胞的制备。第二部分实验中,对7x19FRα-CAR-γδT靶向乳腺癌和三阴乳腺癌细胞株的体外杀伤功能进行了验证,并检测了7x19FRα-CAR-γδT细胞对自身免疫细胞的趋化作用。第三部分实验中,分别建立了乳腺癌和三阴性乳腺癌NOD/SCID小鼠荷瘤模型,将7x19FRα-CAR-γδT细胞经鼠尾静脉输注治疗,同时通过鼠尾静脉输注人PBMC细胞以模拟人体外周血免疫环境。根据移植瘤体积大小及肿瘤组织病理结果,评估7x19FRα-CAR-γδT的体内杀伤效率及其募集多种免疫细胞协同杀伤功能。第一部分7x19FRα-CAR的构建及7x19FRα-CAR-γδT细胞的制备目的:构建含分泌型IL-7和CCL19的嵌合抗原受体FRαsc Fv-CD28-CD3ζ-F2A-IL-7-F2A-CCL19（7x19FRα-CAR）结构,使用慢病毒载体将编码7x19FRα-CAR结构的基因递送至γδT细胞,制备7x19FRα-CAR-γδT。方法:使用重叠PCR法合成编码7x19FRα-CAR和FRα-CAR结构的基因序列,分别将其克隆于p LVX载体中并转染HEK-293T细胞,Western blot分别检测7x19FRα-CAR和FRα-CAR蛋白在HEK-293T细胞中的表达情况;在HEK-293T细胞中包装产生相应的慢病毒颗粒;从健康人外周血采集并纯化γδT细胞,使用含有唑来膦酸、IL-2、IL-15的无血清培养基体外培养并扩增γδT细胞;使用慢病毒颗粒转染γδT细胞,获得7x19FRα-CAR-γδT和FRα-CAR-γδT细胞;流式细胞术分别检测7x19FRα-CAR和FRα-CAR蛋白在γδT细胞表面的表达水平。结果:1.全基因序列合成编码7x19FRα-CAR结构的基因序列,将其克隆入p LVX载体,基因测序证实基因序列正确,无突变。2.Western blot检测到7x19FRα-CAR蛋白在HEK-293T细胞中充分表达且7x19FRα-CAR结构中的自剪切肽可被高效剪切。3.p LVX载体与辅助质粒共转染HEK-293T细胞,可包装获得慢病毒载体,滴度为5E7 TU/ml。4.健康人外周血来源的γδT细胞经磁珠分选后,其纯度可提升至99.7%,体外培养可扩增10~2倍以上。5.流式细胞术检测7x19FRα-CAR在γδT细胞表面表达率为40.7%。第二部分7x19FRα-CAR-γδT细胞的体外生物学功能评价实验研究目的:研究7x19FRα-CAR-γδT细胞的各项生物学功能,评估其在体外抗肿瘤的能力。方法:流式细胞术测定FRα抗原在乳腺癌细胞株MCF-7、三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468以及卵巢癌细胞株C30细胞表面的表达水平;流式细胞术测定趋化因子CCL19的受体CCR7在人DC细胞、人αβT淋巴细胞、人PBMC细胞表面的表达水平;将7x19FRα-CAR-γδT细胞分别与FRα抗原表达水平不同的肿瘤细胞株体外共培养,CCK8法检测7x19FRα-CAR-γδT细胞的体外选择性杀伤活性;ELISA法检测细胞因子IFN-γ、CCL19、IL-7的分泌量;Transwell Assay评估7x19FRα-CAR-γδT细胞趋化DC细胞、T细胞及PBMC靶向迁移的能力。结果:1.流式细胞术结果显示趋化因子CCL19的受体CCR7在αβT淋巴细胞,DC细胞及PBMC中均呈高表达,其中在αβT淋巴细胞中的表达呈“双峰”,可能与αβT淋巴细胞的CD4、CD8表型有关。2.ELISA结果显示γδT、FRα-CAR-γδT未检出IL-7和CCL19分泌,7x19FRα-CAR-γδT细胞可分泌1600±150pg/ml的IL-7和503.3±100.2pg/ml的CCL19;Transwell assay显示7x19FRα-CAR-γδT可以趋化T淋巴细胞,B淋巴细胞和DC细胞靶向迁移。3.7x19FRα-CAR-γδT、FRα-CAR-γδT细胞对FRα表达阳性的乳腺癌细胞株MCF-7、三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-436及MDA-MB-468细胞均有较高杀伤效率,且在相同的效靶比下,7x19FRα-CAR-γδT细胞、FRα-CAR-γδT细胞的杀伤活性显著高于γδT细胞的杀伤活性;但三种效应细胞对FRα表达阴性的C-30细胞的杀伤效率无明显差别。4.FRα表达阳性的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞可以显著刺激7x19FRα-CAR-γδT和FRα-CAR-γδT细胞分泌大量IFN-γ,且7x19FRα-CAR-γδT的分泌量显著高于FRα-CAR-γδT的分泌量,提示IL-7对γδT具有激活作用;而与不表达FRα的C-30细胞共培养后,7x19FRα-CAR-γδT和FRα-CAR-γδT细胞IFN-γ分泌量极低,提示7x19FRα-CAR-γδT和FRα-CAR-γδT的活化具有FRα抗原依赖性。第三部分:7x19FRα-CAR-γδT细胞体内抗瘤的实验研究目的:评估7x19FRα-CAR-γδT细胞在乳腺癌和三阴乳腺癌移植瘤小鼠模型中的抗瘤作用。方法:通过在NOD/SCID小鼠皮下注射乳腺癌细胞株MCF-7细胞或三阴乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞建立乳腺癌或三阴乳腺癌移植瘤动物模型,成瘤后将动物随机分组进行试验;乳腺癌移植瘤动物模型分别尾静脉输注γδT、PBMC、FRα-CAR-γδT及7x19FRα-CAR-γδT细胞;三阴性乳腺癌移植瘤动物模型分别尾静脉输注γδT、PBMC、FRα-CAR-γδT、7x19FRα-CAR-γδT、FRα-CAR-γδT+PBMC、7x19FRα-CAR-γδT+PBMC细胞,观察记录肿瘤的生长体积;肿瘤组织进行HE染色和免疫荧光染色标记T细胞和DC细胞,观察免疫细胞的浸润情况。结果:1.成功建立乳腺癌和三阴乳腺癌皮下移植瘤模型。2.在乳腺癌移植瘤模型中,FRα-CAR-γδT、7x19FRα-CAR-γδT细胞治疗组的肿瘤体积显著小于γδT、PBMC细胞治疗组,统计学分析有显著差异。3.在三阴乳腺癌移植瘤模型中,仅7x19FRα-CAR-γδT+PBMC细胞治疗组肿瘤体积明显缩小,与其他治疗组相比有显著统计学差异。4.在三阴乳腺癌移植瘤切片的HE染色中,7x19FRα-CAR-γδT+PBMC细胞治疗组残存肿瘤组织中可见大量坏死性空泡样结构,IF染色可见大量T淋巴细胞和DC细胞浸润;其余各组未见大量坏死结构及免疫细胞浸润。结论:1.使用含有唑来膦酸、IL-2、IL-15的无血清培养体系能够使γδT细胞在体外实现10~2级别的扩增。2.使用慢病毒载体可将包含有编码7x19FRα-CAR的基因有效递送至γδT细胞,并实现7x19FRα-CAR在细胞中的高水平表达。3.7x19FRα-CAR-γδT能够分泌CCL19趋化DC细胞和T淋巴细胞迁移到肿瘤细胞部位,并在体外高效识别和杀伤FRα表达阳性的三阴乳腺癌细胞。4.7x19FRα-CAR-γδT细胞能够有效抑制乳腺癌移植瘤的生长。通过趋化和募集DC细胞、T淋巴细胞浸润到三阴乳腺癌组织中发挥协同抗肿瘤作用,7x19FRα-CAR-γδT细胞在小鼠体内同样有效抑制了三阴乳腺癌移植瘤的生长。