论文部分内容阅读
目的:观察韭根挥发油对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)糖萼层(ESL)的作用,及其对内皮细胞表达eNOS、caveolin-1、硫酸乙酰肝素等的影响,探讨韭根挥发油对血管内皮ESL的作用机制。方法:1.韭根挥发油的提取:将韭根洗净、阴干,用打粉机粉碎,装入圆底大烧瓶中,浸泡后放入电热套上,通过水蒸气蒸馏法,收集挥发油,再用乙醚萃取3次,得到本试验使用的韭根挥发油。2.人脐静脉内皮细胞的分离培养:洗净脐静脉,注入胶原酶Ⅰ,收集消化液,离心得到人脐静脉内皮原代细胞,使用人第VIII因子相关抗原荧光染色法进行原代细胞鉴定。用DME/F12培养基,于37℃、5%CO2的条件下培养。3.人脐静脉内皮细胞糖萼层(ESL)形态学观察及损伤模型建立:用不同浓度的脂多糖(0?g/mL、0.05?g/mL、0.1?g/mL),分不同的时长(5min、10min、20min、30min)刺激人内皮细胞,使细胞ESL受到损伤。电镜下观察不同浓度LPS在不同时间对内皮细胞ESL形态的影响,为电镜观察ESL的形态变化筛选出适宜LPS浓度和损伤时间。4.韭根挥发油对损伤ESL的作用及机制研究:将人脐静脉内皮细胞随机分为8组,包括正常组,模型组,0.025%韭根挥发油10μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、100μL/mL等不同浓度给药组。ELISA法检测细胞培养上清液中硫酸乙酰肝素(HS)、透明质酸(HA)的含量;Western Blot方法检测人脐静脉内皮细胞eNOS、caveolin-1的表达。结果:1.400g韭根粉末可提取挥发油约0.5mL。2.胶原酶Ⅰ消化得到人脐静脉内皮细胞,细胞贴壁后呈长梭形聚集生长,使用人第VIII因子相关抗原荧光染色法对细胞进行鉴定,证明从脐静脉内消化下来的细胞为人脐静脉内皮细胞。3.人脐静脉内皮细胞ESL受损程度随着LPS浓度的升高和时间的延长而加重。电镜观察内皮细胞ESL形态,0.05?g/mL LPS刺激人脐静脉内皮细胞5min后,ESL已经开始脱落,10min时,与空白对照组相比较,ESL出现了较严重的损伤,但尚有部分残存,并未完全脱落,20min和30min时多数细胞ESL结构已不可见。而0.1?g/mL的LPS干预细胞时,内皮ESL多已消失。所以试验选择LPS对ESL损伤的合适浓度和时间分别为0.05?g/mL、10min。4.韭根挥发油干预损伤内皮细胞后,电镜下可以观察到ESL受损程度减轻;各组细胞上清液中HS、HA含量降低;韭根挥发油干预内皮细胞eNOS和caveolin-1的表达增高。结论:韭根挥发油可以促进HUVECs的生长,降低LPS对内皮细胞ESL的损伤程度,并促进其修复,其作用机制可能通过增加caveolin-1的表达,激活内皮细胞eNOS,维持HUVECs功能,促进损伤ESL修复。