研究背景与研究目的糖尿病肾病(DN)是慢性肾脏病的最常见的病因之一,在糖尿病患者中有较高的发病率和病死率。目前的治疗手段主要是严格的控制血糖和血压,但这些治疗手段只能延缓但不能消除DN的发生和发展。因此,寻找能延缓甚至阻断DN进展的新的治疗策略是十分有必要的。越来越多的研究表明慢性炎症在促进DN的发生和发展中发挥着重要的作用,巨噬细胞是介导肾脏炎症的关键炎症细胞。已有研究发现在糖尿病动物和糖尿病患者的肾组织中,巨噬细胞的聚集明显增加,并且与肾损伤的进展和肾功能的下降程度相关。更重要的是,一些实验研究已经表明,可以直接或间接抑制巨噬细胞浸润的不同的治疗策略都可以有效的防止或改善糖尿病的肾脏损伤。以上证据均表明巨噬细胞介导的肾损伤在DN的发生发展中起重要作用。氧化应激是DN的又一重要的发病机制,它是由机体活性氧(ROS)成分产生增加而导致的与抗氧化系统之间平衡失调引起的一系列的适应性反应。发生氧化应激时,重要的大分子包括蛋白质、脂质、碳水化合物和DNA均发生氧化。糖是ROS产生的主要原料,高糖可以诱导肾小球系膜细胞产生ROS,上调TGF-β和细胞外基质(ECM)蛋白的表达。外源性H2O2或者由葡萄糖氧化酶连续催化产生的H202也可以上调系膜细胞中TGF-β和FN的表达。因此,控制血糖是减少氧化应激的主要干预措施之一。此外,糖尿病时肾脏细胞的糖摄取增多导致了细胞内的糖水平升高,从而引起ROS产生增加,ROS进一步活化信号转导通路和转录因子,进而导致参与肾小球系膜扩张和肾小管纤维化的基因与蛋白表达上调。所以,除了严格控制血糖外,降低糖尿病肾脏细胞ROS产生的另一措施即是增加肾脏易感细胞在高糖环境下减少细胞内糖摄取的能力。一些研究也己表明,减少GLUT膜定位,特别是GLUT1的膜定位的干预措施可以改善实验动物的DN。大量研究都已表明间充质干细胞(MSCs)治疗可以降低血糖,减少尿蛋白,改善肾小球损伤,但具体机制尚不明确。MSCs具有免疫调节功能,它可以抑制T细胞增殖,影响DC细胞的成熟和功能,抑制B细胞的增殖和终末分化等。研究表明MSC作为免疫调节细胞在一系列疾病中均发挥着重要的作用。而且越来越多的研究发现MSC对巨噬细胞的免疫调节作用是MSC改善炎症相关疾病,如伤口愈合、败血症、急性心肌梗塞和肾缺血再灌注损伤的主要机制之一。然而,对在DN的进展过程中的MSC与巨噬细胞的相互关系却了解甚少。MSCs可以持续的表达SOD1, SOD2, CAT, GPX1酶和高水平的谷胱甘肽,具有有效地清除过氧化物和过氧亚硝基阴离子的能力,因此对ROS和活性氮产物的有害作用具有低敏感性。Salmon等人研究还发现MSCs具有解毒活性物质和防止蛋白组及基因组遭遇氧化损伤的酶机制。因此,MSCs被赋予了有效应对氧化应激反应的主要分子机制。但是,有关MSCs能否改善糖尿病肾脏的氧化应激反应及相关机制的研究却十分稀少。依据上述背景,本研究以链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔内注射建立的糖尿病大鼠为模型,以MSCs尾静脉注射来探讨MSCs对糖尿病肾脏中巨噬细胞浸润的作用及对氧化应激的影响,并在体外培养肾小球系膜细胞,与MSCs进行共培养,进一步探讨MSCs影响糖尿病肾脏氧化应激的机制。研究方法1.为明确MSCs对糖尿病肾组织中巨噬细胞浸润的作用,体外分离培养鉴定大鼠骨髓来源的MSCs并用绿色荧光蛋白(GFP)进行体外标记,STZ一次性腹腔内注射建立糖尿病大鼠模型,STZ注射后8周,MSCs连续2周经尾静脉注射,并同时设立正常对照组与疾病对照组,治疗后8周,留取大鼠的血尿及肾组织进行各指标的检测。实验室方法检测各组大鼠的血糖、24h尿蛋白、肌酐清除率及肾肥大指数；PAS染色检测大鼠肾小球纤维化情况；免疫组织化学染色法检测大鼠肾组织中FN、Collagen Ⅰ、ED-1、MCP-1的表达；实时荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测肾组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα和HGF的基因水平和蛋白水平的表达。2.为明确MSCs对糖尿病肾组织中氧化应激的作用及相关作用机制,体外分离培养鉴定大鼠骨髓来源的MSC并用GFP进行体外标记,STZ一次性腹腔内注射建立糖尿病大鼠模型,STZ注射后8周,MSCs连续2周经尾静脉注射,并设立正常对照组与疾病对照组,同时有胰岛素和普罗布考(PB)治疗大鼠作为对照,治疗后8周,留取各组大鼠的血尿及肾组织进行各指标的检测。实验室方法检测各组大鼠的血糖、24h尿蛋白、肌酐清除率及肾肥大指数；PAS染色检测大鼠肾小球纤维化情况；免疫组织化学染色法检测大鼠肾组织中FN、Collagen Ⅰ、TGF-β、GFP的表达；实时荧光定量RT-PCR法检测肾组织中TGF-β基因水平的表达；western blot方法检测各组大鼠肾组织中FN、Collagen I、TGF-β和GLUT1的表达；硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法分别检测肾皮质匀浆中MDA的含量和SOD的活性；化学发光法检测肾冰冻切片上的ROS的表达。体外培养肾小球系膜细胞(GMC)并进行分组如下：GMC; GMC与MSC共培养；培养于MSC培养基(MSC-CM)的GMC,各组均用高糖进行刺激,刺激结束后,检测各组系膜细胞中DHE的表达, western blot方法检测各组系膜细胞中TGF-β和GLUT1的表达；为了评估HGF对系膜细胞中高糖诱导的TGF-β表达的作用和活性氧产生的影响,MSC-CM和新鲜培养基与或者不与HGF中和抗体孵育1h后用于GMC的培养,高糖刺激后western blot方法检测TGF-β的表达,化学发光法检测DHE；为了评估HGF对系膜细胞中TGF-β诱导的GLUT1的表达,MSC-CM和新鲜培养基与或者不与HGF中和抗体孵育后用于GMC的培养,TGF-β刺激后, western blot方法检测GLUT1的表达。研究结果1.MSCs通过抑制巨噬细胞的浸润改善糖尿病大鼠肾小球的纤维化1.1大鼠骨髓MSCs的形态学观察与鉴定大鼠骨髓来源的MSCs具有典型的成纤维细胞形态,贴壁生长,在适当的培养环境下可以向成脂肪细胞和成骨细胞分化,表达CD29, CD90, CD44,不表达CD34, CD45, CDllb。1.2MSCs肾脏内示踪MSCsGFP移植后24h,在肾小球及附近的血管可以观察到少量的MSCsGFP,但在移植后8周,仅在肾小球中发现极少的MSCsGFP细胞。1.3MSCs改善糖尿病大鼠的生理生化指标较DN组相比,MSCs治疗后血糖水平、24h尿蛋白水平及血清肌酐清除率均明显下降,肾肥大指数也有所降低。1.4MSCs改善肾小球纤维化,降低细胞外基质蛋白的表达PAS染色显示DN组大鼠的肾脏表现为系膜区明显的细胞外基质沉积,MSCs治疗明显改善了这些病理异常。免疫组织化学染色显示MSC组大鼠肾脏中FN和Collagen I的表达较DN组明显降低。1.5MSCs对肾脏MCP-1表达和巨噬细胞浸润的作用DN组大鼠肾脏中MCP-1的表达较正常对照组明显升高,但MSCs治疗后明显下降。STZ注射后16周,糖尿病大鼠肾脏肾小球中发现有ED-1细胞(表示巨噬细胞)的浸润,与DN组相比,MSCs治疗明显抑制了肾小球中巨噬细胞的浸润。1.6MSCs对HGF表达的作用ELISA检测发现,MSCs培养基中分泌有大量的HGF因子,在糖尿病大鼠肾组织中,HGF的mRNA和蛋白水平的表达较正常对照组均是明显升高的,MSC组的升高较DN组更加明显。1.7MSCs对炎症因子的作用实时荧光定量RT-PCR和ELISA检测发现,MSC组大鼠肾组织中IL-1β,IL-6, TNFa在基因水平和蛋白水平的表达均较DN组明显下降。2. MSCs通过抑制肾组织中氧化应激改善糖尿病大鼠肾小球的纤维化2.1MSCs改善糖尿病大鼠的血糖和肾功能STZ注射后,糖尿病大鼠的血糖明显升高,但MSC组及Ins组大鼠血糖明显低于DN组及PB组；与DN组相比，PB组,Ins组和MSC组的24h尿蛋白排泄率及血清肌酐清除率水平明显下降；MSCs治疗后,肾肥大指数水平明显低于其他糖尿病大鼠组。2.2MSCs改善肾小球纤维化,降低细胞外基质蛋白的表达PAS染色显示DN组大鼠的肾脏表现为系膜区明显的细胞外基质沉积,肾小球硬化(GS)水平较正常组明显升高,但PB、Ins和MSCs治疗后,GS水平明显降低,MSC组的GS水平较PB组和Ins组更为降低。免疫组织化学染色和western blot结果显示PB组、Ins组和MSC组中的Collagen I和FN的表达较DN组明显降低,MSC组较PB组和Ins组更为降低。2.3MSCs改善糖尿病肾组织和肾小球系膜细胞的氧化应激水平,下调TGF-β的表达较DN组相比,MSC组肾组织中SOD活性明显升高,MDA含量明显下降,肾组织冰冻切片的ROS的表达明显下降,与PB组无明显差异,实时荧光定量RT-PCR,免疫组织化学染色和western blot法均显示MSCs治疗后肾组织中TGF-p mRNA和蛋白水平的表达均明显下降,与PB组、Ins组亦有明显差异。DHE染色显示MSCs共培养和MSC-CM培养的肾小球系膜细胞的活性氧的产生明显减少,TGF-β表达水平明显下调。2.4MSCs对GLUT1蛋白表达的作用Western blot检测显示MSCs共培养和MSC-CM培养的肾小球系膜细胞的GLUT1在细胞膜上的定位明显下调；MSCs治疗后,糖尿病大鼠肾组织膜蛋白中GLUT1的表达明显下调,与DN组和PB组差异明显。2.5MSCs分泌HGF, MSC-CM对高糖刺激诱导的TGF-β表达和活性氧产生及TGF-β诱导的GLUT1表达的作用ELISA检测发现MSC-CM中有大量的HGF因子。Western blot检测显示MSC-CM抑制高糖刺激诱导的TGF-β表达的上调,HGF中和抗体(HGF-Ab)阻断了MSC-CM的抑制作用。与或者不与HGF-Ab孵育的MSC-CM对TGF-β刺激引起的GLUT1膜定位表达的增加均无抑制作用。MSC-CM抑制高糖刺激引起的活性氧产生增加,HGF-Ab阻断了MSC-CM的抑制作用。结论1.MSCs移植对DN具有治疗作用,可以降低血糖,改善肾功能。2.MSCs改善糖尿病肾脏肾小球纤维化情况,减少ECM蛋白的沉积。3.MSCs的作用机制与抑制巨噬细胞浸润有关。MSCs分泌HGF抑制MCP-1的表达,从而减少巨噬细胞的浸润,下调糖尿病肾组织中IL-1β, IL-6, TNFα的表达。4. MSCs的作用机制也与抑制氧化应激有关。MSCs通过降低血糖和减少GLUT1在细胞膜上的定位从而减少细胞内糖摄取进而抑制糖尿病肾脏的氧化应激反应。