乙烯对硅增强烟草悬浮细胞盐耐受性机理的研究及植物交替氧化酶多克隆抗体的制备

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本文分别以烟草悬浮细胞(BY-2)和野生型拟南芥(WT)为实验材料,首先研究了烟草悬浮细胞对盐胁迫的生理响应,探讨了硅对盐胁迫的缓解作用,同时阐述了在烟草悬浮细胞中乙烯与硅缓解盐胁迫作用的相关性及硅对乙烯的影响,并且探讨了乙烯在硅增强烟草BY-2细胞耐盐性中的作用及机制。其次制备了拟南芥交替氧化酶(Alternative Oxidase, AOX)的多克隆抗体。主要结果总结如下:1.在低盐(50 mM NaCl)处理下,烟草BY-2细胞的死亡率无显著影响。在100 mM NaCl与200 mM NaCl处理下,烟草BY-2细胞的死亡率分别增至32%和68%;在低盐和高盐胁迫下,烟草BY-2细胞活力均显著降低,丙二醛(MDA)含量均明显增加,表明盐胁迫造成烟草BY-2细胞氧化损伤。100 mM NaCl处理下,烟草BY-2细胞各个生理指标受损程度比较适中,最终确定其为处理浓度。2.硅能有效缓解盐胁迫对烟草BY-2细胞形态的影响,显著降低盐胁迫下细胞的死亡率,且能部分恢复盐胁迫引起的细胞生长与细胞活力的降低,还能显著降低盐胁迫引起的MDA含量的升高。3.乙烯受体抑制剂AgNO3和乙烯合成抑制剂AOA处理实验发现,在硅缓解盐胁迫的过程中需要乙烯的参与。如果没有乙烯发挥作用,不但硅的缓解作用消失,而且会对烟草BY-2细胞造成更大的伤害。4.随着硅处理时间的延长,乙烯释放量不断增加,处理48 h增加至对照的1.5倍。硅处理条件下,乙烯合成的关键酶基因ACS, ACO的表达均有提高。说明外源硅对烟草BY-2细胞盐胁迫的缓解可能是通过提高乙烯合成酶基因的表达,增加乙烯的含量来实现的。5.硅处理对细胞内活性氧(ROS)含量没有明显影响,但Si+AgNO3处理却导致ROS含量显著增加,处理24 h和48 h时分别增加至对照的1.4和2.0倍。Si+AgNO3处理下可能ROS及其防御系统之间的平衡被打破,细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性发生明显变化。其中POD活性上升,加AgNO3后其活性增加更多;CAT活性基本没有变化,加AgNO3后其活性下降;SOD活性提高,加AgNO3后其活性下降。6.交替氧化酶(AOX)是植物线粒体呼吸链中抗氰呼吸途径的末端氧化酶。为了对其功能进行深入的研究,应用已构建拟南芥AOX基因编码区原核表达载体pET-28a/AOX转化大肠杆菌BL21(DE3),获得可溶性表达产物。用His-tag亲和层析柱分离纯化后作为抗原,免疫兔子,最终制备了抗兔AOX的多克隆抗体。并对AOX多克隆抗体进行了特异性和效价鉴定,该结果为AOX结构与功能的深入研究提供了重要工具。
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