论文部分内容阅读
抑郁症是一种广泛流行的精神性疾病，确切病因尚不清晰，缺乏有效的治疗手段，因此寻找有效的治疗策略具有十分重要的科学意义。逍遥散方作为中国治疗抑郁的经典复方，有一千多年治疗抑郁症等疾病的历史，但其活性成分复杂，作用机理还不明确。近年来研究显示，肠道菌群在抑郁症的发生和治疗中发挥着重要作用，已成为预防和治疗该疾病的新靶点。此外，越来越多的证据证明多种中草药复方可能是通过影响或重塑肠道菌群发挥其功效。因此，综合国内外研究进展，我们猜测以逍遥散为基础的复方中草药可能是通过调节肠道菌群的多样性、结构、功能及特定分类群的丰度，进而发挥其抗抑郁功效。为验证该假说，本课题采用慢性温和不可预知性应激刺激(Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS)联合孤养的方法构建抑郁大鼠模型，借助16SrRNAV4-V5区扩增子测序、液相色谱和质谱(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry， LC-MS)联合技术及宏基因组测序技术，以大鼠粪便及脑组织样本为研究对象，基于肠道菌群探究以逍遥散方为基础的复方中草药对模型大鼠抑郁症状改善的作用机理。具体研究内容及结果如下：
1)采用糖水偏好实验、旷场实验和明暗穿梭实验评估复方中草药干预前后模型大鼠抑郁行为的变化情况。结果显示，复方中草药干预前，相比于健康对照组(Healthy Control，HC)，模型组(CUMS)大鼠的糖水偏好率和旷场得分显著降低、在暗箱中所处时间显著增长；复方中草药干预6周后，相比于CUMS组，各剂量复方中草药干预组(Traditional Chinese Medicine，TCM)大鼠的糖水偏好率和旷场得分均显著升高，且在暗箱中所处时间显著缩短。
2)采用IlluminaHiSeq高通量测序技术对粪便细菌16SrRNAV4-V5区进行系统分析，揭示复方中草药干预前后粪便菌群α多样性、结构和各分类群丰度的变化情况。结果显示，慢性压力不仅显著降低了大鼠粪便菌群的α多样性，而且显著调整了粪便菌群的结构及特定分类群的丰度；复方中草药干预后，TCM组大鼠粪便菌群的结构和特定分类群的丰度得到显著调节，尤其是显著调节了慢性压力诱导的Ruminococcus_2和Roseburia等菌属丰度的变化。
3)基于LC-MS联合技术对复方中草药干预后各组大鼠脑部神经传导物质(五羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、五吲哚乙酸(5-hydroxyindoleaceticacid，5-HIAA)、伽马氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)、乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach))进行靶向定量，揭示复方中草药对CUMS抑郁模型大鼠脑部神经传导物质的影响。靶向代谢结果显示，相比于CUMS组，TCM组中5-HT、5-HIAA、GABA和Ach的水平显著增加。另外，斯皮尔曼(Spearman)相关性分析结果显示，脑部各神经传导物质与粪便各菌属间存在着显著相关性，如毛螺旋菌科UCG-006菌属、未分类的柔嫩菌纲-RF9菌属、胃瘤球菌科UCG-004菌属与5-HIAA呈正相关，而乳酸菌属、Blautia菌属及Ruminococcus_2与其呈负相关；毛螺旋菌科UCG-006菌属和产甾醇类的真菌属与GABA呈正相关；Blautia菌属与Ach呈负相关，而毛螺旋菌科UCG-006菌属与其呈正相关。
4)基于宏基因组测序技术探究复方中草药干预后抑郁模型大鼠粪便微生物功能的变化情况，揭示复方中草药对抑郁模型大鼠粪便菌群功能的影响。结果显示，慢性压力不仅诱导大鼠粪便菌群功能基因的丰度发生显著改变(相比于HC组，CUMS组中COG0582、COG1674、COG4646、ENOG411221R、ENOG410Y01Z、ENOG4112DF3、ENOG410XQ4N、K03205、K03497、K06941、K04763、K03581、K03310、M00202、GH13_3、CBM60、PL17_1、ZP_04049838、ZP_02429913、YP_001896735和P78218的丰度显著降低，而COG5433、M00535、M00502和AA2的丰度显著升高)，而且扰乱了氨基酸代谢功能、显著提高了胆汁酸的生物合成功能；复方中草药不仅显著缓解了慢性压力诱导的部分功能基因丰度的改变(相比于CUMS组，TCM组中COG0582、ENOG411221R、ENOG410Y01Z、ENOG4112DF3、ENOG410XQ4N、COG5433、K03205、K033110、M00202的丰度显著升高，而M00535和M00502的丰度显著降低)，而且显著提高了粪便菌群半胱氨酸和蛋氨酸的代谢水平。
综上可知，慢性压力不仅成功诱导大鼠产生抑郁行为，而且扰乱了大鼠粪便菌群的稳态。另外，复方中草药干预可缓解慢性压力诱导的抑郁行为，推测可能与其调节慢性压力诱导的肠道菌群及脑部神经传导物质失调有关。这一发现不仅为进一步揭示复方中草药、宿主反应、肠道菌群失调与脑神经传导物质水平之间的因果关系奠定了基础，而且为科学地解释该复方的抗抑郁效果提供了理论依据。
1)采用糖水偏好实验、旷场实验和明暗穿梭实验评估复方中草药干预前后模型大鼠抑郁行为的变化情况。结果显示，复方中草药干预前，相比于健康对照组(Healthy Control，HC)，模型组(CUMS)大鼠的糖水偏好率和旷场得分显著降低、在暗箱中所处时间显著增长；复方中草药干预6周后，相比于CUMS组，各剂量复方中草药干预组(Traditional Chinese Medicine，TCM)大鼠的糖水偏好率和旷场得分均显著升高，且在暗箱中所处时间显著缩短。
2)采用IlluminaHiSeq高通量测序技术对粪便细菌16SrRNAV4-V5区进行系统分析，揭示复方中草药干预前后粪便菌群α多样性、结构和各分类群丰度的变化情况。结果显示，慢性压力不仅显著降低了大鼠粪便菌群的α多样性，而且显著调整了粪便菌群的结构及特定分类群的丰度；复方中草药干预后，TCM组大鼠粪便菌群的结构和特定分类群的丰度得到显著调节，尤其是显著调节了慢性压力诱导的Ruminococcus_2和Roseburia等菌属丰度的变化。
3)基于LC-MS联合技术对复方中草药干预后各组大鼠脑部神经传导物质(五羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、五吲哚乙酸(5-hydroxyindoleaceticacid，5-HIAA)、伽马氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid，GABA)、乙酰胆碱(Acetylcholine，Ach))进行靶向定量，揭示复方中草药对CUMS抑郁模型大鼠脑部神经传导物质的影响。靶向代谢结果显示，相比于CUMS组，TCM组中5-HT、5-HIAA、GABA和Ach的水平显著增加。另外，斯皮尔曼(Spearman)相关性分析结果显示，脑部各神经传导物质与粪便各菌属间存在着显著相关性，如毛螺旋菌科UCG-006菌属、未分类的柔嫩菌纲-RF9菌属、胃瘤球菌科UCG-004菌属与5-HIAA呈正相关，而乳酸菌属、Blautia菌属及Ruminococcus_2与其呈负相关；毛螺旋菌科UCG-006菌属和产甾醇类的真菌属与GABA呈正相关；Blautia菌属与Ach呈负相关，而毛螺旋菌科UCG-006菌属与其呈正相关。
4)基于宏基因组测序技术探究复方中草药干预后抑郁模型大鼠粪便微生物功能的变化情况，揭示复方中草药对抑郁模型大鼠粪便菌群功能的影响。结果显示，慢性压力不仅诱导大鼠粪便菌群功能基因的丰度发生显著改变(相比于HC组，CUMS组中COG0582、COG1674、COG4646、ENOG411221R、ENOG410Y01Z、ENOG4112DF3、ENOG410XQ4N、K03205、K03497、K06941、K04763、K03581、K03310、M00202、GH13_3、CBM60、PL17_1、ZP_04049838、ZP_02429913、YP_001896735和P78218的丰度显著降低，而COG5433、M00535、M00502和AA2的丰度显著升高)，而且扰乱了氨基酸代谢功能、显著提高了胆汁酸的生物合成功能；复方中草药不仅显著缓解了慢性压力诱导的部分功能基因丰度的改变(相比于CUMS组，TCM组中COG0582、ENOG411221R、ENOG410Y01Z、ENOG4112DF3、ENOG410XQ4N、COG5433、K03205、K033110、M00202的丰度显著升高，而M00535和M00502的丰度显著降低)，而且显著提高了粪便菌群半胱氨酸和蛋氨酸的代谢水平。
综上可知，慢性压力不仅成功诱导大鼠产生抑郁行为，而且扰乱了大鼠粪便菌群的稳态。另外，复方中草药干预可缓解慢性压力诱导的抑郁行为，推测可能与其调节慢性压力诱导的肠道菌群及脑部神经传导物质失调有关。这一发现不仅为进一步揭示复方中草药、宿主反应、肠道菌群失调与脑神经传导物质水平之间的因果关系奠定了基础，而且为科学地解释该复方的抗抑郁效果提供了理论依据。