克氏原螯虾(Procambarus clarkii)又称小龙虾,在分类学上隶属于节肢动物门、甲壳纲,是一种重要的淡水养殖虾品种。在其整个生命周期中,蜕皮次数高达十几次,且只有经过蜕皮才能实现性成熟。而蜕皮受到多种因素的调控,其中消化酶类扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯虾α-淀粉酶基因并分析了蜕皮激素对α-淀粉酶表达水平的影响。本实验根据已有部分序列,设计特异性引物克隆出克氏原螯虾α-淀粉酶ORF(open reading frame)c DNA序列。生物信息学分析表明克氏原螯虾α-淀粉酶ORF长1545bp,编码的蛋白质含514个氨基酸残基,其氨基端19个疏水性氨基酸残基为信号肽。预测的成熟蛋白的理论相对分子量为55.1 k Da,等电点为4.95.通过双酶切法构建重组质粒p ET-28a-amy,转化至E.coli Rosetta(DE3),用不同浓度IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot的检测结果表明克氏原螯虾α-淀粉酶融合蛋白能够在原核表达系统中高效表达,但是重组蛋白质主要以包涵体形式存在。用Ni-NTA亲和层析柱对α-淀粉酶重组蛋白包涵体进行纯化并免疫制备多克隆抗体,ELISA检测其抗体效价为1:60000。透析法复性纯化后的重组蛋白,DNS法测定其酶活为1425±28 U/mg。提取克氏原螯虾肝胰腺、心脏、肠道、胃、肌肉、鳃6个不同组织的总蛋白和总RNA,通过免疫印迹法和实时定量PCR法分析克氏原螯虾α-淀粉酶的组织表达差异。结果表明Pc-amy RNA在各组织中表达量差异显著,在肝胰腺中表达量最高,其次是胃,而其他组织中表达量极低。蜕皮激素刺激48 h后Pc-amy表达量明显下降,表明α-淀粉酶能够应答克氏原螯虾蜕皮激素诱导信号。