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原发性肝癌是一种以高发生率、高复发率和高死亡率为特征的侵袭性恶性肿瘤,发病率仅次于肺癌、前列腺癌、大肠癌和胃癌,严重威胁着人类的健康。全身剂量的化疗药物作为晚期肝癌临床治疗的常规手段,可能会引起患者非特异性细胞毒性反应,导致患者预后不佳。如何提高肝癌对化疗药的敏感性从而降低药物剂量、减少副作用已经成为目前肝癌治疗研究的重点。多西紫杉醇(Docetaxel,DTX)是一种紫杉烷类抗癌药,在临床上被广泛用于治疗非小细胞癌、乳腺癌和肝癌等恶性肿瘤。多西紫杉醇可以与游离的微管蛋白相结合,促进微管聚合并抑制其解聚,调节微管动力学,从而抑制细胞有丝分裂过程。体内体外实验证明,多西紫杉醇对肝癌细胞有较好的杀伤作用。尽管单用多西紫杉醇对肝癌有一定的作用,但其不良反应限制了高剂量使用。因此,有必要针对肿瘤细胞对多西紫杉醇的反应机制进行深入探讨,以期获得能够增强肿瘤细胞对多西紫杉醇敏感性的新的分子机制,为其临床抗肿瘤应用提供新的治疗策略。组蛋白去乙酰化酶6(Histone Deacetylase6,HDAC6)是定位于细胞质的Ⅱb类组蛋白乙酰基酶,拥有两个串联同源的且独立起作用的催化结构域DDI和DD2。除了之外,HDAC6不但可以将组蛋白去乙酰化,还可以与细胞质中的非组蛋白底物相互作用,这有别于组蛋白去乙酰化酶家族(Hi stone Deacetylase,HDAC)的其他成员。HDAC6在多种肿瘤组织中高表达。有研究报道,HDAC6可以与泛素标记的错误折叠蛋白和动力蛋白(dynein)结合形成三聚体,三聚体沿着微管将错误折叠蛋白运输到微管组织中心形成功能性聚集体结构,从而降解错误折叠蛋白。有趣的是,微管亚单位α-微管蛋白(α-tubulin)是HDAC6非组蛋白底物之一,其被HDAC6去乙酰化后可调控微管动力学,在自噬体和溶酶体融合过程中扮演着重要角色。因此,HDAC6被抑制时,可导致肿瘤细胞中错误折叠蛋白大量累积,细胞毒性增加从而诱导细胞死亡,所以推测HDAC6可能是一个临床肿瘤治疗的潜在靶点。Tubacin是第一个被开发出的HDAC6特异性抑制剂,在实验室研究中发现其与多种化疗药物联合应用具有协同作用。如tubacin与硼替佐米合用治疗EB病毒相关淋巴细胞瘤,和长春新碱合用可抑制恶性胶质瘤的增殖等,其可能机制是调节α-tubulin中赖氨酸残基乙酰化水平,通过调节微管动力学以达到抗肿瘤效果,然而具体机制尚不完全清楚。综上,HDAC6特异性抑制剂tubacin和多西紫杉醇抗癌的机制均与微管动力学的调控有关,那么tubacin和多西紫杉醇联合作用是否能够协同调控微管将治疗效果最大化呢?故本研究基于人肝细胞癌细胞模型,首先验证多西紫杉醇和tubacin的抗癌效果,然后基于实验表征多西紫杉醇和tubacin在人肝细胞癌细胞中的生物学作用,进一步探讨多西紫杉醇和tubacin联合应用的抗肿瘤效果及机制。实验方法:(1)Western blot法和HDAC6酶活性试剂盒检测不同浓度tubacin对人肝细胞癌SNU449细胞、SNU387细胞内Ac-α-tubulin表达和酶活性的影响。(2)细胞存活率检测:MTT法检测DTX、tubacin、DTX+tubacin对人肝细胞癌SNU387细胞、SNU449细胞存活率的影响。(3)细胞增殖能力检测:实时无标记细胞分析技术(RealTime CellμL ar Analysis,RTCA)实时监测细胞存活状态,检测tubacin联合DTX对人肝细胞癌SNU387细胞、SNU449细胞增殖能力的影响;(4)细胞侵袭、迁移能力检测:Transwell侵袭实验、细胞划痕实验分别检测tubacin联合DTX对人肝细胞癌SNU387细胞、SNU449细胞侵袭、迁移的影响。(5)细胞周期:流式细胞术检测DTX联合tubacin对人肝细胞癌SNU387细胞、SNU449细胞细胞周期的影响。(6)Western blot法和HDAC6酶活性试剂盒检测DTX联合tubacin对人肝细胞癌SNU387细胞、SNU449细胞中Ac-α-tubulin表达水平和酶活性的影响;间接免疫荧光实验检测SNU387细胞、SNU449细胞中Ac-α-tubulin的表达变化。(7)细胞核形态:Hoechst染色检测DTX联合tubacin对人肝细胞癌SNU387细胞、SNU449细胞细胞核形态的影响。实验结果:(1)梯度浓度tubacin作用于人肝细胞癌SNU449细胞、SNU387细胞24h,结果显示10 μmol/L tubacin即可显著增加Ac-α-tubulin表达,显著抑制HDAC6的酶活性。(2)在SNU449细胞中,与对照组相比,DTX组细胞存活率明显降低;与DTX组相比,DTX+tubacin组细胞存活率进一步降低。在SNU387细胞中,与对照组相比,DTX组细胞存活率无明显变化;与DTX组相比,DTX+Tubacin组细胞存活率明显降低。(3)在SNU449细胞、SNU387细胞中,与对照组相比,DTX组的细胞倍增时间增加,与DTX组相比,DTX+tubacin组的细胞倍增时间进一步增加。(4)在SNU449细胞、SNU387细胞中,与对照组相比,DTX组细胞侵袭、迁移的能力明显降低,与DTX组相比,DTX+tubacin组细胞侵袭、迁移的能力进一步降低。(5)在SNU449细胞、SNU387细胞中,与对照组相比,DTX组S期、G2/M期细胞量没有明显变化,与DTX组相比,DTX+tubacin组的S期、G2/M期细胞量降低明显。(6)在SNU449细胞、SNU387细胞中,与对照组相比,DTX组Ac-α-tubulin表达量增高,HDAC6活性降低,与DTX组相比,DTX+tubacin 组 Ac-a-tubulin 表达显著增高,HDAC6活性进一步降低。(7)在SNU449细胞、SNU387细胞中,与对照组相比,DTX组细胞核异常核分裂程度增加,与DTX组相比,DTX+tubacin组细胞核异常核分裂程度进一步增加。结论:在人肝细胞癌SNU449细胞和SNU387细胞中,多西紫杉醇和tubacin有正向协同作用,联合用药可显著抑制肝癌细胞增值及侵袭迁移,多西紫杉醇联合tubacin通过影响微管蛋白乙酰化导致细胞核异常分裂,进而阻滞细胞周期,增加抗癌敏感性。本研究可能为增加多西紫杉醇的敏感性提供新思路。