在内毒素和TNF-α相关疾病的分子机制中，内毒素可刺激诱导TNF-α等炎性因子大量释放，而TNF-α又是最为重要的介导内毒素休克等疾病的起始因子。TNF-α以跨膜前体的形式表达于细胞膜上，主要由TNF-α转换酶（TACE）水解加工后，才能释放到胞外基质、血液和组织液中，诱发炎症等反应，TACE高表达或活性增高是内毒素和TNF-α相关疾病的重要分子基础之一。TNF-α作为一种前炎症因子，又可促进其它多种促炎细胞因子的表达释放，其中包括许多炎症诱导型的趋化因子及其受体，启动多种炎性细胞的趋化浸润，导致趋化部位的细胞炎性反应。　　根据以上有关内毒素和TNF-α相关疾病的分子机制，本文从两个方面对内毒素和TNF-α致病作用进行分子干预，一方面通过噬菌体肽库技术筛选TACE抑制肽，从而抑制TNF-α的水解释放;另一方面通过克隆表达炎症诱导型趋化因子受体CXCR3并制备其抗体，对其抑制炎性细胞的趋化作用进行初步探讨。　　第一部分 基于阻断TNF-α释放的炎症干预途径——TACE抑制肽的筛选和功能研究　　肿瘤坏死因子α转换酶(tumour necrosis factor-α convertingenzyme，TACE)是加工水解跨膜型TNF-α前体，释放出成熟分泌型TNF-α的关键酶。研究表明，TACE在特定位点(Ala76-Val77)水解TNF-α跨膜前体，然后将TNF-α释放到血液或组织中。TNF-α是介导炎症及其并发症的主要细胞因子，在TNF-α介导的炎症及相关疾病中，几乎都有TACE高表达或活性增高，因此，TACE已被国际上确立为用于治疗TNF-α导致炎症等相关疾病的新靶标。本研究借助噬菌体肽库技术进行TACE肽类抑制剂的研究，克隆表达TACE胞外功能结构域作为噬菌体肽库的筛选靶分子，根据阳性克隆的序列合成短肽并观察其是否能抑制TACE的活性。　　一、重组TACE胞外功能结构域的表达纯化及抗血清制备　　用RT-PCR从人外周血单核细胞中分别扩增出TACE的催化区(T800)和整个胞外区(T1300)，然后分别克隆至pET-28a和pET-28c中，经酶切和测序鉴定正确。将pET-T800和pET-T1300转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白，两者均为包涵体，变性复性后过Ni2+-NTA亲和层析柱得到纯度达90％的重组蛋白，用抗TACE抗体进行Western blot验证。结果表明获得足量且纯度较高的重组T800和T1300蛋白。　　分别以纯化的T800和T1300为抗原免疫兔子，收集抗血清，用硫酸铵沉淀等方法纯化。抗血清的效价经ELISA测定在1∶10万以上，其Western blot和免疫组化的检测结果与阳性对照抗体相比无明显区别，为深入研究TACE表达分布和功能提供充足的抗体。　　二、TACE结合肽的筛选和鉴定　　分别以T800和T1300包被酶标板，再分别加入f3-15mer或f88-cys4噬菌体肽库，进行四轮“结合-洗脱-扩增”亲和筛选。在筛选过程中，通过增加用于预吸附肽库的BSA浓度、减少肽库的滴度和亲和吸附时间、增加洗脱强度等方法，去除非结合和较弱结合的噬菌体。从第四轮结合洗脱的噬菌体铺板上，随机挑取单个克隆进行扩增，小量提取噬菌体后，通过ELISA鉴定、竞争抑制实验和序列分析，确定能分别与T800和T1300特异结合的序列。　　结果，以T800为靶蛋白对f3-15mer噬菌体肽库筛选出了5个强阳性序列，编号为C2、C3、C8、C9和C10;以T1300为靶蛋白对f3-15mer噬菌体肽库筛选出了1个强阳性序列C27和若干个中等阳性的序列。经测序分析表明，C2、C8、C9、C10和C27碱基序列完全相同，其对应的短肽序列为:N端-TRWLVYFSRPYLVAT-C端。以T800为靶蛋白对f88-cys4噬菌体肽库筛选出了3个中等阳性序列;以T1300为靶蛋白对f88-cys4噬菌体肽库也筛选出了2个中等阳性序列。经测序分析表明，A1和A3碱基序列完全相同;B1和B2碱基序列完全相同。　　三、TACE结合肽的化学合成及细胞学功能研究　　根据TACE结合肽的筛选和鉴定结果，选择从f3-15mer肽库筛选出来的强阳性一致性序列用于短肽的化学合成。短肽合成由西安美联生物技术公司协助完成，采用固相Fmoc法合成，合成产物采用HPLC纯化，通过质谱分析测定其分子量。　　由于T1300重组蛋白具有天然TACE的酶活性，通过ELISA法检测合成肽与T1300的结合活性，结果表明，合成肽与T1300的亲和力较高。　　以LPS刺激PBMC产生sTNF-α为实验模型，采用ELISA检测PBMC上清中sTNF-α的变化。结果表明，合成的短肽具有抑制sTNF-α产生的功能，随着肽的浓度加大，上清中sTNF-α减少。合成肽浓度在50 mg/L时，可使sTNF-α的产生下降60.3％，其IC50约为10mg/L。　　用FACS检测PBMC表面mTNF-α的变化，以进一步确证sTNF-α的减少是由于TACE水解mTNF-α的能力下降所致。结果显示，由于TACE受其结合肽的抑制，其水解mTNF-α产生sTNF-α的能力降低，因而细胞表面mTNF-α的平均荧光强度(Mean Fluorescence Units，MFU)相应增加。　　四、合成肽的体内动物实验　　取20g左右昆明小鼠，以尾静脉注射0.1ml含D-氨基半乳糖铵10mg和0.4-1μg LPS的溶液，来制备小鼠内毒素血症模型。治疗组为内毒素血症模型制备30min前，先注射一定剂量的合成肽。对照组为只注射合成肽溶解液（含1％DMSO的生理盐水）。各实验组6h后，将小鼠处死，取腹腔巨噬细胞用于进一步检测mTNF-α的变化，取肝脏和肾脏做病理切片。以FACS检测内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞mTNF-α的变化，结果合成肽可使内毒素血症小鼠腹腔巨噬细胞mTNF-α表达增高或阳性比例增大。　　合成肽的体内抗炎效应通过行为反应观察和病理切片检查评估。结果，用合成肽治疗内毒素血症小鼠，可使小鼠厌食、寒战、离群和嗜睡等症状明显减轻。病理切片检查表明，合成肽可对抗LPS引起的肝脏和肾脏组织炎性反应，使变性、坏死减轻。　　第二部分 基于阻断CXCR3趋化效应的炎症干预途径——小鼠CXCR3胞外N末端的表达、抗体制备及其初步应用　　趋化因子受体为与G蛋白偶联、含有7个跨膜区的跨膜蛋白，依其结构特点又可分为多个亚类，其中CXCR3主要表达于激活的T细胞、B细胞和NK细胞表面，其高表达是淋巴细胞发生定向迁移募集的重要条件，在炎症浸润、细胞迁移、血管形成、移植排斥反应和某些肿瘤的发生中都起着重要的作用。　　小鼠CXCR3全长由367个氨基酸组成，其中1～57位氨基酸为胞外N末端结构域，该结构域参与CXCR3与其配体的识别、结合和信号传导过程。在分离BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞后，以5μg/ml终浓度的ConA刺激细胞24h，然后用RT-PCR扩增出编码CXCR3的全长cDNA序列，引物为(P1)5-TCCCAACCACAAGTGCCAAAG-3和(P2)5-GCCCAACTACCAGGAGGACAAG-3。以全长cDNA为模板扩增出CXCR3的N末端，与DsbA（突变型）进行融合表达，表达产物rCXCR3(N)-DsbA为可溶性形式，表达量约占全菌总蛋白的40％，Western blot分析显示带有His标签的表达产物可与抗His抗体发生抗原抗体反应，镍柱纯化后获得纯度大于90％的重组蛋白。　　以rCXCR3(N)-DsbA免疫家兔，获得兔抗rCXCR3(N)-DsbA抗血清，ELISA检测效价大于1∶10万。用硫酸铵沉淀法初步纯化了抗血清，然后与过量的DsbA充分结合吸附后，得到仅针对CXCR3胞外N末端的特异抗体。ELISA检测表明，抗血清只与rCXCR3(N)-DsbA反应，而不与单独的DsbA反应。给小鼠尾静脉注射ConA，36～48小时后取脾脏淋巴细胞，再用尼龙毛法分离出活化了的T细胞，加入系列浓度的纯化rCXCR3(N)-DsbA或抗血清，用RPMI-1640调细胞浓度为2×106，置趋化板上层，趋化板下层加趋化因子进行趋化实验。结果表明，rCXCR3(N)-DsbA和抗血清可抑制T细胞的趋化效应，其中抗血清的抑制作用最强，10μg/ml的抗体可完全抑制rIP-10对T细胞的趋化作用，rCXCR3-DsbA的作用弱于抗血清，而DsbA不能减弱rIP-10对T细胞的趋化作用。　　本文在对小鼠CXCR3进行原核表达研究的时候，发现其全长不能有效表达，用pET28a单独表达CXCR3胞外N末端时，表达量较低（约10％），并且为包涵体，与DsbA融合表达则取得了良好效果，提示DsbA具有良好的促进外源蛋白可溶表达的能力。　　本研究中，我们制备的重组CXCR3胞外N末端融合蛋白及其抗体都能抑制淋巴细胞的趋化效应，但重组蛋白的抑制效果不如其抗体效果显著，这可能与重组蛋白对趋化因子竞争结合的作用要小于抗体对淋巴细胞上趋化因子受体的封闭作用有关。