论文部分内容阅读
人工合成的寡核苷酸（ODNS）广泛应用于基因的诊断和治疗。作为一种有效的基因表达调节工具，反义寡核苷酸已经发展成为一种新型的靶向基因治疗药物。未修饰的天然寡核苷酸容易被内源性核酸酶所降解，而且有些还发现具有严重的副作用。然而带有合适的化学修饰基团的寡核苷酸，在体内具有较强的稳定性，副作用小，比相应的未修饰的寡核苷酸更具有活力。目前寡核苷酸几乎都是使用DNA合成仪进行化学合成，大规模的制备和纯化十分困难，不仅设备成本非常高，而且使用危险化学品。在之前的研究中，我们提出了一种用于大量制备反义寡核苷酸的核酸扩增技术—聚合酶-内切酶扩增反应（Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR）。在本文中的第一部分，我们用PEAR技术制备了硫代磷酸修饰和2’-氟修饰的反义寡核苷酸，利用电喷雾液相色谱-质谱联用技术（ESI/LC/MS）对PEAR产物进行检测，分析了PEAR产物的各个组分。分析结果显示PEAR产物的纯度高达100.0%。PEAR产物的双链可用反向高效液相色谱(RP-HPLC)技术进行拆分和纯化，获得正义链和反义链。利用PEAR技术，通过“滑动-切割”的机制，能够使用少量的化学合成的寡核苷酸种子，制备大量的高纯度的目标寡核苷酸。与化学合成的方法相比，具有成本低，纯度高，易纯化，易大量制备等优点。证明了PEAR技术可以作为大量制备修饰的反义寡核苷酸的一种工具。文章的第二部分，我们检测了PEAR产物的生物学活性。一般情况下反义寡核苷酸是以单链形式在细胞中或者体内发挥作用的。PEAR的产物为双链寡核苷酸的重复序列，使用之前必须将PEAR产物进行完全酶切和分离双链。据报道，双链寡核苷酸能够更有效地抑制基因表达，据此我们推断PEAR制备的双链寡核苷酸也应该能够有效地抑制基因表达。据报道，miR-30家族能够通过抑制p53基因的途径，来抑制细胞的凋亡，促进细胞的癌变。因此我们把miR-30a作为研究目标，利用PEAR技术制备靶向作用于miR-30a的双链寡核苷酸重复序列（anti-miR-30a），用脂质体转染技术导入胃癌细胞，利用流式细胞仪检测胃癌细胞的凋亡率。转染后24h检测结果显示，未修饰的anti-miR-30a和2’-氟修饰的anti-miR-30a处理组，细胞的凋亡率要显著高于空白对照组，而且2’-氟修饰的anti-miR-30a处理组的促进细胞凋亡的效率相对更明显。所以我们初步推断用PEAR技术制备靶向作用于miR-30a的寡核苷酸重复序列，能够抑制胃癌细胞中miR-30a的表达，进而促进p53基因的表达，使细胞凋亡率增加，而且2’-氟修饰的比未修饰的寡核苷酸重复序列稳定性要强，抑制效果更好。因此我们初步推测PEAR制备的寡核苷酸双链重复DNA具有特异性地抑制基因表达的生物学活性，但尚需进一步实验证实此现象，并研究其作用机制。