背景:糖尿病（diabetic mellitus,DM）是以血糖升高为特征的一种全身慢性代谢性疾病,长期代谢紊乱引发诸多并发症,如冠心病、脑中风、视网膜病变和糖尿病肾病等,且病程长、预后差、病死率高。国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF）数据显示 202 1 年全球糖尿病的患病人数达5.37亿,约500万人因糖尿病死亡。其中,2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）占糖尿病患者的 90-95%,已成为继恶性肿瘤和心血管疾病之后的第三大慢性疾病。药物干预仍是目前临床治疗糖尿病的最主要手段,但现存的治疗药物在临床治疗方面均存在一定的局限性。因此,研发安全有效、针对新靶点的降糖药物一直是该领域的研究热点。此外,T2DM患者多为老年人,且同时患有多种基础疾病,如肥胖、恶性肿瘤、心血管疾病等,需长期同时服用多种药物,不仅使患者面临诸多药物副作用的潜在风险,也给个人和社会带来沉重负担,研发同时具有多种药理活性的药物并阐明其相应药理作用机制具有重要的科学意义和重大的社会效益。雷公藤红素（Celastrol,Cel）具有非常广泛的药理学作用,包括抗风湿、抗肿瘤、抗阿尔兹海默症等,被Cell（2007年130卷5期）杂志列为最有可能被开发成为现代药物的5种传统天然药用化合物之一。研究表明雷公藤红素能够减轻胰岛素抵抗,提高胰岛素的敏感性,减轻db/db糖尿病小鼠的肾损伤和肝脏损伤,并能降低体重。虽然现有研究表明雷公藤红素具有潜在的治疗糖尿病及防治并发症的作用,但是其降糖作用靶点及具体分子机制并不是很清楚,这对将雷公藤红素开发为降糖药物并进一步通过成药性改进降低其毒副作用是一个大的阻碍。因此,阐明雷公藤红素降糖作用靶点及分子机制对将其开发为具有多靶点、多适应症的降糖药物具有重要的科学意义和临床价值。方法:一、雷公藤红素改善T2DM的作用研究1.以db/db T2DM小鼠为动物模型,体内研究雷公藤红素对小鼠血糖、体重、摄食量以及葡萄糖耐量的影响;采用免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测雷公藤红素对小鼠胰腺胰岛素分泌的影响;2.建立大鼠胰岛瘤INS-1细胞高糖模型,酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测雷公藤红素对胰岛素分泌的影响;Western blotting检测雷公藤红素对胰岛素表达相关基因胰岛素受体β（Insulin receptor β,IR-β）和肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物 A 基因（Musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family,protein A,MafA）表达的影响;3.建立人肝癌HepG2细胞高糖模型,2-NBDG实验检测雷公藤红素对葡萄糖摄取的影响;Western blotting检测雷公藤红素对糖异生相关基因磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,PCK1）和葡萄糖 6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency,G6PD）表达的影响。二、雷公藤红素下调硫氧还蛋白互作蛋白（Thioredoxin-interacting protein,TXNIP）的机制研究1.Real-time PCR检测雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞中TXNIP mRNA水平的影响;Western blotting检测雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞中TXNIP蛋白表达的影响;IHC检测雷公藤红素对小鼠胰腺和肝脏中TXNIP表达的影响;2.Western blotting 检测在放线菌酮（Cycloheximide,CHX）阻断蛋白合成的情况下雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞中TXNIP蛋白稳定性的影响;Real-time PCR检测在放线菌素D（Actinomycin D,ActD）阻断mRNA合成的情况下雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞中TXNIP mRNA稳定性的影响;3.双荧光素酶报告质粒实验检测雷公藤红素对TXNIP启动子活性的影响。三、雷公藤红素对TXNIP的转录因子碳水化合物反应原件结合蛋白（Carbohydrate-responsive element-binding protein,ChREBP）调控作用研究1.采用分子对接的方法评估雷公藤红素与ChREBP的结合活性;采用药物靶点亲和性分析实验（Drug affinity responsive target stability,DARTS）结合质谱分析检测雷公藤红素与ChREBP的亲和性;采用细胞热转变分析实验（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）检测雷公藤红素与ChREBP在细胞内的相互作用;2.Western blotting检测雷公藤红素对INS-1细胞、HepG2细胞以及小鼠胰腺及肝脏中ChREBP蛋白表达的影响;3.采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒分离INS-1和HepG2细胞的细胞浆与细胞核,western blotting检测雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞的细胞浆与细胞核中ChREBP蛋白表达的影响;免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞中ChREBP核转位的影响;4.Western blotting检测在CHX阻断蛋白合成的情况下雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞中ChREBP蛋白稳定性的影响;real-time PCR检测在ActD阻断mRNA合成情况下雷公藤红素对INS-1和HepG2细胞中ChREBP mRNA稳定性的影响;在HepG2细胞中过表达ChREBP,采用western blotting检测雷公藤红素对外源性ChREBP蛋白表达的影响;5.Western blotting检测蛋白酶体抑制剂MG132及溶酶体抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）是否能阻断雷公藤红素对在INS-1和HepG2细胞中对ChREBP蛋白的下调;在HepG2细胞中过表达ChREBP,免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）实验检测雷公藤红素是否促进ChREBP蛋白的泛素化。四、雷公藤红素通过ChREBP-TXNIP轴改善T2DM1.构建过表达ChREBP的质粒pCDNA3.1-FLAG-ChREBP,转染HepG2细胞,western blotting检测雷公藤红素对ChREBP、TXNIP蛋白表达的影响;Real-time PCR检测雷公藤红素对TXNIP mRNA水平的影响。2.siRNA 敲低 ChREBP,western blotting 检测雷公藤红素对 INS-1细胞中胰岛素表达相关基因IR-β和MafA表达水平的影响;ELISA检测雷公藤红素对INS-1细胞中胰岛素分泌的影响;3.siRNA 敲低 ChREBP,western blotting 检测雷公藤红素对 HepG2细胞中糖异生相关基因PCK1和G6PD表达水平的影响;结果:一、雷公藤红素能够改善T2DM1.雷公藤红素能够显著降低db/db T2DM小鼠的血糖水平,雷公藤红素0.25 mg/kg、0.5 mg/kg和1mg/kg给药6周后,降糖率分别为32.04±4.63%、37.08±6.18%和 73.73±4.63%。此外,雷公藤红素能够减少db/db T2DM小鼠摄食量,降低体重,改善小鼠葡萄糖耐量受损;2.雷公藤红素能够逆转高糖损伤的INS-1细胞中胰岛素的分泌,上调胰岛素表达相关基因IR-β和MafA蛋白的表达;3.雷公藤红素能够逆转高糖损伤的HepG2细胞对葡萄糖的摄取,抑制糖异生相关基因PCK1和G6PD蛋白的表达。二、雷公藤红素通过转录水平下调TXNIP1.雷公藤红素能够显著降低TXNIP mRNA水平（P＜0.05或P＜0.01）和TXNIP的蛋白水平,且雷公藤红素能够降低db/db小鼠胰腺及肝脏中TXNIP蛋白的水平;2.与单独的放线菌酮组比较,放线菌酮联合雷公藤红素处理组没有进一步降低INS-1和HepG2细胞中TXNIP蛋白水平;与单独的放线菌素D组比较,放线菌素D联合雷公藤红素处理组也没有进一步降低细胞中TXNIP mRNA水平,表明雷公藤红素并不促进INS-1和HepG2细胞中TXNIP蛋白和mRNA降解。此外,双荧光素酶报告基因结果表明雷公藤红素能够抑制TXNIP启动子活性,综合上述结果表明雷公藤红素从转录水平下调TXNIP表达。三、雷公藤红素与TXNIP转录因子ChREBP直接结合,促进其泛素化降解1.分子对接结果表明雷公藤红素与ChREBP有两个结合位点,结合能分别为-9.4 kcal/mol和-9.3 kcal/mol;DARTS实验结合质谱分析结果表明ChREBP确实为雷公藤红素的作用靶点;CETSA实验结果表明雷公藤红素能够使ChREBP的热熔曲线右移。综合上述结果表明雷公藤红素能够与ChREBP直接结合,ChREBP为雷公藤红素的作用靶点;2.雷公藤红素能够下调INS-1细胞、HepG2细胞以及小鼠胰腺及肝脏中ChREBP蛋白的表达;3.雷公藤红素能够下调INS-1和HepG2细胞中ChREBP蛋白的表达,IF结果表明雷公藤红素还能够抑制ChREBP进入细胞核;4.与单独的CHX组比较,CHX联合雷公藤红素处理组进一步降低INS-1和HepG2细胞中ChREBP蛋白水平,与单独的ActD组比较,ActD联合雷公藤红素处理组没有进一步降低INS-1和HepG2细胞中ChREBP mRNA 水平。此外,雷公藤红素能够下调外源性ChREBP 蛋白的表达,表明雷公藤红素能够促进INS-1和HepG2细胞中ChREBP蛋白的降解;5.溶酶体抑制剂CQ没有逆转雷公藤红素对ChREBP的下调作用,蛋白酶体抑制剂MG132能够逆转雷公藤红素对ChREBP的下调作用,IP实验结果进一步表明雷公藤红素能够促进ChREBP蛋白的泛素化降解,综合上述结果说明雷公藤红素通过蛋白酶体-泛素化方式下调ChREBP。四、雷公藤红素通过ChREBP-TXNIP轴促进胰岛素分泌、抑制糖异生,从而发挥降糖作用1.在HepG2细胞中过表达ChREBP后,TXNIP mRNA和蛋白水平都同步上调,雷公藤红素能显著下调TXNIP mRNA及蛋白水平,说明雷公藤红素可作用于ChREBP-TXNIP轴;2.在INS-1细胞中敲低ChREBP后,TXNIP蛋白表达下调,雷公藤红素干预后未进一步下调TXNIP的表达,雷公藤红素对INS-1细胞中IR-β和MafA的上调作用被逆转,雷公藤红素促进高糖损伤的INS-1细胞胰岛素分泌的作用也被逆转,说明雷公藤红素通过ChREBP-TXNIP轴发挥促进高糖损伤的INS-1细胞胰岛素分泌的作用;3.在HepG2细胞中敲低ChREBP后,TXNIP蛋白表达下调,雷公藤红素干预后未进一步下调TXNIP的表达水平,且糖异生相关基因G6PD的下调作用被逆转,说明雷公藤红素通过ChREBP-TXNIP轴发挥抑制糖异生,促进葡萄糖稳态的作用。结论:1.雷公藤红素能够促进db/db T2DM小鼠胰岛素分泌,改善葡萄糖稳态,和降低血糖水平;2.雷公藤红素通过与转录因子ChREBP直接结合,促进ChREBP的泛素化降解和抑制ChREBP核转位,在转录水平下调TXNIP的表达;3.雷公藤红素通过靶向ChREBP-TXNIP轴促进INS-1细胞胰岛素分泌、抑制细胞糖异生,从而发挥改善T2DM的作用。上述研究结果表明,雷公藤红素具有显著的降血糖作用,其作用机制为雷公藤红素通过与ChREBP直接结合,促进ChREBP泛素化降解和抑制ChREBP核转位,从而下调TXNIP的转录,打破ChREBP-TXNIP轴的正反馈循环导致的TXNIP异常升高的恶性循环,最终逆转TXNIP介导的胰岛素抵抗、葡萄糖代谢紊乱及胰岛β细胞功能障碍,从而发挥降糖作用;研究揭示ChREBP是雷公藤红素直接结合的降糖作用靶点,为将雷公藤红素开发为降糖药物并进一步通过成药性改进降低其毒副作用提供新的线索和思路,为T2DM患者,尤其是患有多种基础疾病的患者临床用药方案的制定提供理论依据和实验基础,对雷公藤红素成为安全有效、符合现代医学要求的新兴药物具有科学意义和应用价值。