口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病。由于FMDV变异快、血清型多,通过疫苗免疫单一手段难以有效防控。因此,需要探索包括天然免疫在内的多种途径,综合防控口蹄疫。天然免疫特别是抗病毒基因是阻止病毒感染的第一道防线。病毒入侵宿主细胞后,病毒诱导产生干扰素(IFN),I-IFN和III-IFN在抗病毒感染的先天免疫过程中发挥重要的作用,能启动、激活Mx(Myxovirus-resistant)等抗病毒通路。研究表明,Mx蛋白可直接作用于多种RNA病毒和DNA病毒,具有天然的抗病毒功能,在天然免疫研究领域具有十分重要的地位。然而,牛Mx1抗FMDV作用尚不清楚。本研究利用过表达和基因沉默技术,发现牛Mx1具有抗FMDV活性,并从牛Mx1对FMDV基因组RNA复制及其作用病毒蛋白两个层面探讨了牛Mx1抗FMDV的分子机制,主要试验结果如下:1.建立牛Mx1稳定表达细胞系BHK21-Mx1,免疫荧光技术验证牛Mx1在细胞质内表达,牛Mx1具有抗FMDV活性。利用RT-PCR方法扩增到牛Mx1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Mx1,真核表达的Mx1蛋白带有Flag标签;pcDNA3.1-Mx1转染293T细胞,瞬时表达量高;再将pcDNA3.1-Mx1和空载pcDNA3.1分别转染FMDV的易感细胞BHK-21,经G418筛选,获得单克隆细胞,对克隆细胞进行半跨越PCR、Western blot鉴定,筛选出高表达牛Mx1的克隆,经传代60d以上,仍保持Mx1高表达状态,获得稳定表达牛Mx1的细胞系BHK21-Mx1及对照细胞BHK21-3.1;利用Flag单克隆抗体进行免疫荧光染色,牛Mx1蛋白表达于细胞质内;将稳定表达牛Mx1细胞系BHK21-Mx1感染FMDV,48h内能抵御FMDV 100TCID50的攻击,BHK21-Mx1的细胞病毒液的TCID50比对照组BHK21-3.1降低10倍以上。结果表明,牛Mx1可抑制FMDV的复制与增殖,牛Mx1具有抗FMDV功能。2.利用FMDV天然易感细胞模型,建立沉默牛Mx1的牛胎儿原代气管上皮细胞,反向验证了牛Mx1具有抗FMDV功能。针对牛Mx1基因编码区,设计、合成shRNA引物,构建慢病毒H1重组载体;将构建的shRNA重组载体分别与pcDNA3.1-Mx1载体共转染293T细胞,Western blot检测牛Mx1的表达,筛选出对牛Mx1干扰效率最高的载体;再转染牛胎儿原代气管上皮细胞,经流式细胞分选,获得GFP阳性细胞,有限稀释法培养细胞,对培养10d以上的表达GFP的克隆细胞,进行PCR和Western blot检测,获得沉默牛Mx1的细胞BTPE-siMx1及对照细胞BPTE-LacZ;利用荧光定量RT-PCR方法,确定牛胎儿原代气管上皮细胞的α-IFN诱导终浓度1×104IU/ml、诱导时间为6h,牛Mx1表达量最高;进行100TCID50的FMDV感染,发现沉默Mx1细胞系BPTE-siMx1培养物的FMDV滴度显著高于对照细胞BPTE-LacZ。结果表明,沉默牛Mx1促进了FMDV的增殖,从反向验证了牛Mx1具有抗FMDV功能。3.建立FMDV链特异性荧光定量RT-PCR(ssqRT-PCR)检测方法,对FMDV基因组RNA定量分析,发现牛Mx1能抑制FMDV基因组RNA的复制。通过比对FMDV基因组序列,确定保守的基因序列,引入非病毒的标签序列设计分别扩增FMDV正链和负链RNA引物,建立了FMDV ssqRT-PCR荧光定量检测方法,具有较好的灵敏性、特异性、重复性;在FMDV感染8h、16h、24h后,过表达牛Mx1细胞BHK21-Mx1的正链RNA拷贝数比对照细胞BHK21-3.1高20倍、34倍和22倍,同时BHK21-Mx1细胞的负链RNA拷贝数比对照细胞BHK21-3.1高为12倍、19倍和17倍;而牛Mx1沉默细胞BPTE-siMx1正链RNA的拷贝数比对照细胞BPTE-Lac Z高29倍、47倍和14倍,同时BPTE-siMx1细胞的负链RNA的拷贝数比对照细胞BPTE-LacZ高为24倍、32倍和14倍。结果表明,牛Mx1可抑制FMDV基因组RNA的复制。4.原核表达FMDV的P1、P2、P3蛋白,制备兔抗血清,Western blot检测到在牛Mx1作用下2C蛋白量降低;利用GST pull-down和免疫共沉淀方法,确认牛Mx1可作用于FMDV 2C蛋白的N端,发挥抗病毒功能。成功构建了FMDV的P1、P2、P3基因的pET32a原核表达载体,并纯化到相应的蛋白,制备了兔多克隆抗体;Western blot技术检测,FMDV感染牛Mx1稳定细胞系BHK21-Mx1的细胞培养物,与对照细胞相比,2C蛋白量显著降低;成功构建了带有GST标签的牛Mx1和2C的原核表达载体,并纯化到相应蛋白,通过GST pull-down实验,表明牛Mx1可与FMDV 2C结合;成功构建了带有HA标签的pcDNA3.1-2C载体,与pcDNA3.1-Mx1共转染293T细胞,免疫共沉淀正反两方向都证实了牛Mx1蛋白和FMDV2C蛋白发生相互作用。通过构建表达2C蛋白缺失突变体,发现牛Mx1可能作用于FMDV2C蛋白的N端。