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背景结核病是一种古老的疾病,考古学家从新石器时代人类的骨化石和埃及4500年前的木乃伊上就发现了脊柱结核。据世界卫生组织报道,目前全球范围内,结核病仍是十大死亡原因之一,也是主要的单一传染源。2018年,全世界估计有1000万人患有结核病,其中男性570万,女性320万,儿童110万,共有150万人死于结核病。结核病的防控与治疗对于全球的健康卫生体系仍旧是一个具有挑战性的突出问题,亟待提出新方法、新思路来解决。目前临床上迫切需要一种能够高效、准确并快速锁定结核病患者的诊断方法。目的通过结核病患者和健康对照的血浆低丰度蛋白组学分析鉴定,寻找一个结核病诊断生物标志物或者一组生物标志物组合。方法(1)对18例肺结核患者和18例健康对照的血浆去除高丰度蛋白后,使用TMT标记定量蛋白组学技术分析差异表达蛋白;(2)依靠生物信息学方法对差异表达蛋白进行蛋白注释、功能富集分析和蛋白互作网络分析;(3)根据平行反应监测(PRM)靶向蛋白组学技术特性选取适合的差异表达蛋白进行验证,通过受试者工作特征(ROC)曲线分析和留一法交叉验证(LOOCV)两种方法分别对单独生物标志物及标志物组合进行分析;(4)使用酶联免疫吸附测定(ELISA)验证方法对潜在的生物标志物做进一步验证,使用ROC曲线分析和LOOCV方法分别对单独生物标志物及标志物组合进行分析。结果(1)TMT标记蛋白质组学分析显示,在P<0.05,倍数变化>1.2或<0.8333的条件下,结核组与健康组相比,有43个上调蛋白和71个下调蛋白。在生物信息学分析中,最具有显著性的是hsa04610补体和凝血级联通路,富集了 16个差异表达蛋白。(2)使用PRM靶向质谱验证了一组具有结核病诊断潜力的7个差异表达蛋白,分别是A2M、APOA4、CFH、CFHR5、FGB、FGG和MBL2。采用ROC曲线分析和LOOCV方法对每种蛋白以及每种组合的表现进行验证。ROC分析中,CFHR5+FGB+FGG+MBL2是最优生物标志物组合,ROC曲线下面积(AUC)为0.868,敏感性为0.733,特异性为0.889。LOOCV方法分析得到最优标志物组合A(A2M+APOA4+CFHR5+FGB+FGG)有80%正确分类的原始已分组个案,70%正确分类的交叉验证已分组个案,80%正确分类的原始已分组结核个案和66.7%正确分类的交叉验证已分组结核个案。综合两种分析方法,最有潜力的候选蛋白生物标志物有A2M、APOA4、CFHR5、FGB、FGG和MBL2。(3)ELISA验证实验涉及到9个蛋白,分别是:C4d、C5a、C9、CFH、FBG(由两组 FGA、FGB、FGG 多肽链组成)、IP-10、MBL2、SAA2和SERPINA1,采用ROC曲线分析和LOOCV两种方法对9个蛋白的单独表现以及组合进行了分析验证。ROC分析结果中,MBL2和C5a在结核组与非结核组相比具有显著差异性,同时曲线下面积AUC>0.7,MBL2的诊断敏感性是0.579,特异性是0.828,C5a的诊断敏感性是0.833,特异性是0.615。在LOOCV分析中,表现最为靠前的单独分析的生物标志物仍是MBL2,有73.7%正确分类的原始已分组个案和73.7%正确分类的交叉验证已分组个案;标志物组合 1(C4d+C5a+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2+SERPINA1)是分析后综合分数最高的标志物组合,有61.4%正确分类的原始已分组个案和89.5%正确分类的交叉验证已分组个案,89.5%正确分类的原始已分组结核个案和78.9%正确分类的交叉验证已分组结核个案;标志物组合 2(C4d+C5a+C9+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2)的正确分类的交叉验证已分组个案和正确分类的交叉验证已分组结核个案是所有组合方案中得分最高的,分别是93%和84.2%。综合两种分析方法,最有潜力的候选蛋白生物标志物有C4d、C5a、C9、CFH、FBG、IP-10、MBL2、SAA2、SERPINA1。结论(1)基于TMT标记的定量蛋白质组学技术,对结核组和健康对照组的血浆低丰度蛋白进行分析,鉴定到结核组差异表达蛋白114个,其中上调蛋白43个,下调蛋白71个。(2)运用PRM靶向蛋白组学验证得到,最有潜力的结核生物标志物候选蛋白有A2M、APOA4、CFHR5、FGB、FGG和MBL2;最优的结核生物标志物组合是CFHR5+FGB+FGG+MBL2,ROC曲线下面积(AUC)为0.868,敏感性为0.733,特异性为0.889。(3)通过ELISA实验对可能的生物标志物做进一步验证得到,最有潜力的标志物候选蛋白有C4d、C5a、C9、CFH、FBG、IP-10、MBL2、SAA2 和 SERPINA1;鉴定出 2 组较为理想的结核标志物组合,分别是生物标志物组合1(C4d+C5a+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2+SERPINA1)和生物标志物组合 2(C4d+C5a+C9+CFH+FBG+IP-10+MBL2+SAA2)。(4)本论文中通过PRM靶向蛋白组学技术和ELISA两种验证方法均证实MBL2是具有显著性差异的结核生物标志物,为后续的功能探究及疾病进展研究提供了有力支持。