孔石莼氨基酰化酶和碱性磷酸酶的分离纯化和性质分析

来源 :东北林业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dawulitao
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研究了氨基酰化酶和碱性磷酸酶在大连地区常见海藻中的分布状况,从中筛选出孔石莼作为纯化研究对象,并从孔石莼中分离纯化出了这两种酶,纯度达到了聚丙烯酰胺凝胶电泳一条带。在此基础上,研究了两种酶的一些基本性质和EDTA对孔石莼碱性磷酸酶的抑制动力学。 1.研究了氨基酰化酶在七种绿藻、七种褐藻和十七种红藻,共计三十一种海藻中的分布状况,以及随时间、地点和生长阶段的不同而产生的变化。 2.利用硫酸铵分级沉淀和两次凝胶层析从孔石莼粗提液中分离纯化得到了孔石莼氨基酰化酶,纯度达到了SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳一条带,纯化后的酶比活性达到了104U/mg。 3.孔石莼氨基酰化酶由两个相同的亚基组成,分子量为156kD,亚基分子量为78kD;该酶进行催化的最佳pH值是7.0;最适温度是37℃;六种底物中对N-乙酰-DL-丙氨酸的活性最高;锌离子和钴离子对酶活性有增强作用;PMSF对酶活性没有影响;钾盐和盐酸盐在IM浓度以下对酶活性没有影响,而钠盐和硫酸盐在较低浓度下即对酶活性有较强影响,并且随着浓度的升高而加剧。 4.研究了碱性磷酸酶在五种绿藻、六种褐藻和十八种红藻,共计二十九种海藻中的分布状况,以及随时间、地点和生长阶段的不同而产生的变化。 5.利用硫酸铵分级沉淀和亲和层析从孔石莼粗提液中分离纯化得到了孔石莼碱性磷酸酶,纯度达到了SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳一条带,纯化后的酶比活性达到了48.6U/mg。 6.孔石莼碱性磷酸酶由四个相同的亚基构成,分子量为76kD,亚基分子量为19kD;该酶进行催化的最佳pH值为9.9;最适温度为37℃;米氏常数Km为0.950mM和最大反应速率Vmax为5.00μM/min;镁离子对酶活性基本没有影响,但是钴离子、镍离子和铜离子对酶活性有明显抑制作用;2.5mM的DTT即能够令酶完全失活,表明酶活力对分子中二硫键有完全依赖作用;NBS对酶活性有部分抑制作用,表明酶活性与色氨酸残基有关。 7.EDTA对孔石莼碱性磷酸酶和小牛肠碱性磷酸酶的抑制动力学均为络合型不可逆抑制,但是二者在抑制过程中具体情况稍有不同。
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