[目 的]肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的一种,是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,尤其在我国和东南亚高发,且是由癌症导致死亡的常见疾病。肿瘤转移是肿瘤相关死亡的主要原因。然而,驱动肿瘤转移的机制尚未完全研究清楚。长链非编码RNA snaR（long non-coding RNA snaR,Lnc RNA snaR）是一种肿瘤激活因子,研究发现Lnc RNA snaR可在多种癌症中发挥致癌作用,但在HCC中的尚未有研究报道。据报道,上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）、JAK 激酶/信号转换器和转录激活因子 3（Janus kinase/signal transducer and activator of the transcription,STAT3）信号通路的激活在肿瘤的迁移、侵袭过程中具有重要的作用。在此,本课题旨在探讨LncRNA snaR对HCC迁移和侵袭的影响及其机制:1、LncRNA snaR对HCC疾病进展的相关性和预后评估;2、LncRNA snaR与TGF-β 1、ERK、JAk/STAT3信号通路在HCC细胞中相互作用对EMT、肿瘤发生迁移和侵袭的影响。[方 法]1、临床相关研究:（1）收集昆明医科大学第二附属医院肝胆外科2011年1月至2013年12月收治的HCC患者的233例数标本,经过纳入及排出标准筛选后选取了32位男性及24位女性的标本,平均年龄在49.2±6.4岁。该实验标本收集、知情同意等程序经由昆明医科大学第二附属医院伦理委员会讨论审核批准后执行。标本收集整理后行HE染色再次确定组织类型:HCC组织、癌旁组织、正常肝组织。（2）通过Q-RT-PCR检测分别HCC组织、HCC患者血浆、健康人对照组血浆中LncRNA snaR的表达水平;ELISA检测HCC患者及健康人对照组血浆中的TGF-β 1的表达水平;针对LncRNA snaR与TGF-β1在血浆中的表达水平进行Pearson相关性分析;（3）进行回顾性分析LncRNA snaR表达高低与HCC临床病理相关性因素之间的联系;（4）利用Kaplan-Meier分析进行LncRNA snaR表达高低和HCC患者的临床终点之间的关联,绘制总生存期（over survival,OS）、无病生存期（disease-free survival,DFS）曲线。2、LncRNA snaR对HCC细胞迁移与侵袭作用的研究:（1）培养人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株SMMC7721、正常肝细胞株HL7702。分子克隆获得LncRNA snaR基因序列,利用pcDNA3.1构建用LncRNA snaR表达质粒、合成LncRNA snaR siRNA,分别转染HepG2、SMMC7721、HL7702细胞,Q-RT-PCR检测细胞中LncRNA snaR的表达水平;（2）利用基因过表达或si-RNA干扰技术处理HCC细胞,Transwell实验检测LncRNA snaR对HCC细胞迁移与侵袭能力的影响。3、LncRNA snaR对HCC细胞EMT作用的研究:（1）利用Western Blot实验检测LncRNA snaR对EMT标志性蛋白（E-钙黏蛋白E-cadherin、N-钙黏蛋白N-cadherin、波形蛋白Vimentin）及MMPs（MMP2、MMP9）蛋白表达的作用;（2）免疫荧光实验（Immunofluorescence,IF）检测LncRNA snaR对HCC细胞E-cadherin的作用。4、LncRNA snaR与TGF-β 1对HCC细胞迁移与侵袭作用的研究:本项目从信号转导通路的调节机制入手,利用基因过表达或si-RNA干扰技术进行以下实验,（1）Transwell实验检测LncRNA snaR与TGF-β 1对HCC细胞迁移与侵袭能力的影响;（2）Western Blot实验检测LncRNA snaR对TGF-β 1蛋白表达水平的影响以及TGF-β 1对LncRNA snaR表达水平的影响;（3）RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测LncRNA snaR与TGF-β 1的相互作用。5、LncRNA snaR与ERK、JAK/STAT3信号通路对HCC细胞迁移与侵袭作用的研究:本项目从信号转导通路的调节机制入手,利用基因过表达或si-RNA干扰技术进行以下实验,（1）Western Blot实验检测TGF-β 1对ERK、STAT3蛋白表达水平的影响;（2）免疫荧光实验（IF）检测HCC细胞中LncRNA snaR、ERK、JAK/STAT3对 E-cadherin 蛋白的影响;（3）Western Blot 实验检测 LncRNA snaR过表达载体转染HCC细胞不同时程中总ERK、磷酸化ERK（P-ERK）、总STAT3、磷酸化STAT3（P-STAT3）表达水平的影响;（4）Western Blot实验检测ERK与JAK/STAT3之间的相互作用关系;（5）Transwell实验检测ERK、JAK/STAT3对LncRNA snaR诱导的HCC细胞迁移与侵袭的影响。[结 果]1、临床相关研究发现:（1）LncRNA snaR在HCC组织、血浆中的表达较正常增加（P<0.05）,TGF-β 1在HCC在HCC血浆中的表达较正常增加（p<0.05）,且HCC患者血浆中LncRNA snaR与TGF-β 1水平呈正相关性。（2）HCC组织、血浆中LncRNA snaR的高表达水平与肿瘤远处转移显着相关。（3）HCC患者中LncRNA snaR的高表达与缩短的总生存期（over survival,OS）（p=0.01,HR=0.36）和无病存活（disease-free survival,DFS）（p=0.01,HR=0.41）显著相关。2、LncRNA snaR对HCC细胞迁移与侵袭作用的研究发现:过表达LncRNA snaR可促进HCC细胞HepG2的迁移与侵袭;siRNA干扰LncRNA snaR减弱HCC细胞HepG2的迁移与侵袭（p<0.05）。3、LncRNA snaR对HCC细胞EMT作用的研究发现:（1）过表达LncRNA snaR可明显增加HCC细胞HepG2中N-cadherin、Vimentin的表达水平,而过表达LncRNA snaR可明显抑制HCC细胞 HepG2 中 E-cadherin 的表达水平（p<0.05）。相反,用 siRNA 干扰 LncRNA snaR后HCC细胞HepG2中N-cadherin、Vimentin的表达水平显著下降,而siRNA干扰LncRNA snaR后可大大促进HCC细胞HepG2中E-cadherin的表达（p<0.05）。免疫荧光检测发现与对照组相比,过表达LncRNA snaR使HCC细胞HepG2中E-cadherin表达的水平降低（p<0.05）。（2）在HCC细胞HepG2中过表达LncRNA snaR可明显增加MMP9、MMP2的表达水平（p<0.05）,而siRNA干扰LncRNA snaR后可明显降低HCC细胞HepG2中MMP9的表达水平（p<0.05）,但siRNA干扰LncRNA snaR后HCC细胞HepG2中MMP2的表达水平降低不显著（p>0.05）。4、LncRNA snaR与TGF-β 1对HCC细胞迁移与侵袭作用的研究发现:（1）Transwell实验发现,TGF-β 1可促进HCC细胞HepG2的迁移与侵袭;si-snaR可以抑制TGF-β 1诱导的HCC细胞HepG2的迁移与侵袭（p<0.05）。（2）通过Transwell实验发现,与对照组相比,过表达LncRNA snaR组的HepG2细胞迁移能力和侵袭能力明显增强（P<0.05）。然而,用TGF-β 1抑制剂SD 208以10 ng/ml的剂量处理后显著减弱了 LncR snaR对HCC细胞HepG2迁移和侵袭能力的作用（p<0.05）。（3）与对照组相比,在LncRNA snaR过表达的HepG2细胞中TGF-β 1表达显著上调（P<0.0.5）。相反,用浓度为10和30ng/ml的外源性TGF-β 1处理HepG2细胞,外源性TGF-β 1对LncRNA snaR表达没有显着影响（p>0.05）。且用si-RNA干扰LncRNA snaR后,TGF-β 1蛋白表达水平显著下降（p<0.05）。（4）RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验验证了 LncRNA snaR与TGF-β 1之间存在相互作用关系。5、LncRNA snaR与ERK、JAK/STAT3信号通路对HCC细胞迁移与侵袭作用的研究发现:（1）Westen blot实验发现,与对照组相比,加入外源性TGF-β 1后可明显增加HepG2细胞中ERK、STAT3的蛋白水平的表达。（2）免疫荧光实验发现与对照组相比,加入外源性与对照组相比,过表达LncRNA snaR使HepG2细胞中E-cadherin蛋白表达的水平降低（p<0.05）;而使用ERK抑制剂（U0126）抑制ERK活性、JAK抑制剂（AG490）抑制JAK/STAT3信号通路活性后可挽救HepG2细胞中E-cadherin蛋白的降解（p<0.05）。（3）细胞时程实验发现,用LncRNA snaR过表达载体转染HepG2细胞后,磷酸化ERK（phospho-ERK,P-ERK）的表达水平以时间依赖性方式增加,并且在1小时达到峰值,与对照组相比增加近1.4倍（p<0.05）;同样地,磷酸化STAT3 Tyr705（phospho-STAT3 Tyr705,P-STAT3 Y705）的表达水平在 LncRNA snaR 过表达载体转染后近15分钟达到峰值,与对照组相比增加近1.5倍（p<0.05）。类似地,磷酸化 STAT3 Ser727（phospho-STAT3 Ser727,P-STAT3 S727）的表达水平后来才达到峰值,大多数在刺激后1小时达到峰值,类似于ERK的峰值时间（p<0.05）。在此实验中并没有观察到总ERK蛋白水平和总STAT3蛋白水平有明显变化（p>0.05）。（4）Westen blot 实验发现,与 LncRNA snaR 过表达组（snaR）相比,用JAK抑制剂AG490处理HCC细胞导致磷酸化ERK表达水平明显降低（p<0.05）。在 AG490 预处理和 snaR-vector 转染组（A+snaR）中,过表达 LncRNA snaR后可挽救因JAK抑制剂AG490引起的HCC细胞中磷酸化ERK表达水平的降低（P<0.05）。此外,与LncRNA snaR过表达组（snaR）相比,用ERK抑制剂U0126导致磷酸化STAT3 Ser727（P-STAT3 ST27）（p<0.05）的磷酸化水平明显降低,且观察到磷酸化STAT3 Tyr705（P-STAT3 Y705）水平也降低（p<0.05）。在U0126预处理和snaR-vector转染组（U+snaR）中,过表达LncRNA snaR后也可挽救因ERK抑制剂U0126引起的HCC细胞中磷酸化磷酸化STAT3 Ser727（P-STAT3S727）和磷酸化 STAT3 Tyr705（P-STAT3Y705）表达水平的降低（p<0.05）。（5）利用基因过表达及si-RNA干扰技术,通过Transwell实验发现,与对照组相比,使用U0126封闭ERK可明显减少LncRNA snaR促进HCC细胞迁移的作用（图p<0.05）;类似地,使用XL019封闭JAK也可明显减少LncRNA snaR促进HCC细胞迁移的作用（P<0.05）;使用C188-9封闭STAT3亦明显减少LncRNA snaR促进HCC细胞迁移的作用（p<0.05）。另外,我们实施了 Matrigel侵袭实验,结果证明与对照组相比,使用U0126封闭ERK可明显减少LncRNA snaR促进HCC细胞侵袭的作用（P<0.05）;类似地,使用XL019封闭JAK也可明显减少LncRNA snaR促进HCC细胞侵袭的作用（p<0.05）;使用C188-9封闭STAT3亦明显减少LncRNA snaR促进HCC细胞侵袭的作用（p<0.05）。[结 论]1、LncRNA snaR在HCC组织、血浆中的表达较正常增加,TGF-β 1在HCC血浆中的表达较正常增加,且HCC患者血浆中LncRNA snaR与TGF-β 1水平呈正相关性。HCC组织、血浆中LncRNA snaR的表达水平与肿瘤远处转移显着相关。高表达LncRNA snaR与HCC患者缩短的OS、DFS显著相关,LncRNA snaR的过度表达可能是HCC患者预后不良的因素之一。2、过表达LncRNA snaR可促进HCC细胞的迁移与侵袭;siRNA干扰LncRNA snaR减弱HCC细胞的迁移与侵袭。3、LncRNA snaR参与HCC细胞的EMT,过表达LncRNA snaR促进HCC细胞中MMP9、MMP2的表达。4、LncR snaR对HCC细胞迁移和侵袭能力的调控可能是通过TGF-β 1来实现的。5、LncRNA snaR通过激活HCC细胞中的ERK和JAK/STAT3通路来促进HCC细胞的迁移与侵袭。