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背景与目的苯并(a)芘(Benzo[a]pyrene, B[a]P)是一种常见的环境污染物,广泛存在于燃煤和吸烟过程中,是一种间接致癌物。流行病学和实验研究提示B[a]P暴露与人类肺癌的发生密切相关。PTEN抑癌基因的失活与人类多种肿瘤的发生发展相关。microRNA (miRNA)是最近发现的一类在多物种间高度保守、对基因具有负调控作用的非编码小分子RNA。最近研究发现,人类肿瘤中miRNA的异常表达常伴随着基因表达的异常改变。本研究利用B[a]P的代谢衍生物反式-7,8-二羟-9,10-环氧苯并芘(anti-benzo[a]pyrene-trans-7,8-diol-9,10-epoxide, anti-BPDE)诱导的恶性转化第30代人支气管上皮细胞(16HBE-T30)及其前期第15代细胞(16HBE-T15)为模型,分析microRNA-494(miR-494)和microRNA-22(miR-22)的表达,并利用生物信息学软件预测得到其共同的靶基因PTEN。通过miRNA过表达和抑制表达处理模型细胞,检测PTEN相应的表达改变,并利用报告基因证实作用靶序列。同时进一步研究了miRNA在致癌过程中的功能。本研究阐明了miRNA在B[a]P诱导细胞恶性转化过程中的作用及其对PTEN基因的调控行为,为肺癌的基因治疗和预防提供了进一步的理论依据。方法1.生物信息学预测利用TargetScan、Pictar和RNAhybrid等miRNA靶基因预测软件和网站,对可能作用于PTEN 3’端非翻译区(3’UTR)的miRNA进行预测分析。2. miRNA和PTEN表达水平的检测用SYBR Green定量RT-PCR检测经anti-BPDE恶性转化人支气管上皮细胞(16HBE-T30)及其前期第15代细胞(16HBE-T15),以及相应的对照细胞(16HBE-N30和16HBE-N15)中miR-494、miR-22成熟体和PTEN基因在mRNA水平的表达改变。对PTEN基因在蛋白水平的表达改变则利用Western blot检测。3. miRNA前体分子和抑制剂瞬时转染按照siPORT? NeoFX?说明书进行转染。前体转染组设实验组(pre-miR-494和pre-miR-22)和阴性对照组(pre-miR-nc),抑制剂组设实验组(anti-miR-494和anti-miR-22)和阴性对照组(anti-miR-nc)。24h后检测转染效率,72h后检测miRNA和PTEN表达改变情况。4.报告基因构建及双萤光素酶活力检测将含有野生型或突变型miRNA作用靶点的片段分别插入到pLG3载体的萤光素酶下游3’UTR中,重组后的载体分别命名为WT和MT,经EcoR I酶切鉴定并测序验证。用双萤光报告检测试剂盒进行萤光素酶活力检测,WT和MT均设有抑制剂处理组和阴性对照组(anti-miR-494、anti-miR-22和anti-miR-nc)及前体处理组和阴性对照组(pre-miR-494、pre-miR-22和pre-miR-nc)。采用Lipofectamin2000将RNA寡核苷酸与质粒DNA共转染,用pRL-TK海肾萤光素酶对转染效率进行标准化。5.细胞凋亡检测96孔板中进行细胞转染48h后,用ApoONE Homogeneous Caspase-3/7试剂盒,按说明操作,对各处理组细胞中Caspase-3/7活力进行检测,以阴性对照组进行标准化处理。Hoechst 33258细胞核DNA片段染色,6孔板中转染细胞60h后,无血清培养12h诱导细胞凋亡,4%福尔马林室温固定,PBS冲洗后进行Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察并计数凋亡细胞。6.软琼脂实验检测细胞集落形成率在6孔板中,每孔中加入底层琼脂,冷却30min后,再加入含1000个细胞的2ml顶层琼脂,待其凝固后,置于37℃CO2温箱中培养14d,观察并计数集落形成率。7.细胞划痕实验细胞转染24h后接种到24孔板,待其长至完全融合。用小吸头在平板上进行划线,再以无血清培养基将脱落的细胞冲洗干净,37℃培养24h后,显微镜下拍照。8.统计分析各实验组数据按均数±标注差(±s)表示,并根据资料的性质利用SPSS13.0统计软件分别进行方差分析和t检验。P <0.05为有显著性差异。结果1.生物信息学分析运用生物信息学软件分析表明,在PTEN 3’UTR中存在miR-494和miR-22的3个潜在作用靶点,miRNA与靶点之间的自由能绝对值较高,且靶序列在多物种间高度保守。2. 16HBE-T15和16HBE-T30细胞中miRNA和PTEN的表达16HBE-T30细胞中,miR-494、miR-22表达水平分别是16HBE-N30的12.6±1.7倍和2.3±0.1倍(P<0.05);而在16HBE-T15细胞中,miR-494和miR-22表达水平分别是16HBE-N15的0.34±0.1倍和0.62±0.1倍(P<0.05)。定量RT-PCR检测PTEN mRNA的表达改变没有统计学差异(P>0.05),而Western blot分析16HBE-T30中PTEN蛋白表达是16HBE-N30的0.60±0.1倍(P<0.05),但16HBE-T15细胞的PTEN蛋白表达与16HBE-N15的比较无统计学差异(P>0.05)。miRNA表达与PTEN蛋白表达之间呈负相关关系。3. miRNA干扰后PTEN蛋白的表达改变转染抑制剂或miRNA前体72h后,抑制剂组的miRNA表达均呈下降趋势,而前体组呈上升趋势。相反,在miR-494和miR-22抑制剂处理组细胞中,PTEN蛋白分别上升0.27±0.1倍和0.48±0.02倍(P<0.05);在miR-494和miR-22前体处理组细胞中,PTEN蛋白分别下降0.16±0.09倍和0.48±0.1倍(P<0.05)。4.双报告基因检测确认miRNA靶基因重组载体经酶切和测序鉴定验证后,确认为目的重组载体(。1)不对miRNA进行干扰,转染WT载体的16HBE-T30组的标化萤光素酶值比16HBE-N30的低,同时也比转染MT载体组的低(P<0.05)。(2)对miRNA进行干扰,转染WT载体的抑制剂干扰组中,anti-miR-494组、anti-miR-22组和anti-miR-nc组的标化萤光素酶值分别为18.3%±1.1%、20.4%±0.9%和12.8%±0.5%,前二者均比后者高(P<0.05);转染MT载体的抑制组中3组间的标化萤光素酶值无统计学差异(P>0.05),但3组的标化萤光素酶值均比转染WT载体组中anti-miR-nc组的值高(P<0.05)。WT载体的前体干扰组中,pre-miR-494组、pre-miR-22组和pre-miR-nc组的标化萤光素酶值分别为6.4%±0.3%、5.8%±0.8%和10.8%±0.6%,前二者均比后者低(P<0.05);转染MT载体的前体组中3组间的标化萤光素酶值无统计学差异(P<0.05),而3组的萤光素值均比转染WT组中的pre-miR-nc的值高(P>0.05)。说明miR-494和miR-22对PTEN的调控作用是通过其靶点来实现的,作用靶点种子序列的突变可以使PTEN逃避miR-494和miR-22的调控。5. miR-494和miR-22参与细胞凋亡过程在16HBE-T30细胞中,抑制剂处理显示,转染anti-miR-494和anti-miR-22细胞的Caspase-3/7的活力比anti-miR-nc组的高,分别上升0.6±0.2和0.5±0.1倍(P<0.05)。前体组显示,转染pre-miR-494和pre-miR-22细胞的Caspase-3/7的活力分别是pre-miR-nc的0.82±0.03倍和0.84±0.05倍(P<0.05)。在16HBE-N30细胞中,pre-miR-494组(0.73±0.10倍)与pre-miR-22组(0.87±0.02倍)低于pre-miR-nc组(P<0.05)。Hoechst 33258 DNA片段染色显示,在16HBE-T30细胞中抑制miR-494和miR-22的表达能增加细胞凋亡比例。6. miRNA干扰后细胞集落形成率的改变anti-miR-494(5.9%±0.9%)和anti-miR-22(6.2%±1.1%)处理的16HBE-T30细胞与其阴性对照处理细胞(11.6%±0.9%)比较,集落形成率均明显降低(P<0.05)。7.细胞划痕实验anti-miR-494(50.6%±1.5%)和anti-miR -22(74.8%±2.5%)处理的16HBE-T30(93.9%±4.4%)细胞与其阴性对照处理细胞比较,生长细胞覆盖率均明显减少(P<0.05),说明细胞泳动能力明显降低。结论1. anti-BPDE诱导人支气管上皮细胞恶性转化存在早期阶段miR-494和miR-22成熟体表达下调,而晚期阶段表达明显上调的现象;而这两个阶段PTEN蛋白的表达与miRNA表达成相反的趋势,晚期明显下调。2. PTEN基因是miR-494和miR-22的靶基因,后二者通过前者的3个靶序列而发挥它们的调控作用,miR-494和miR-22的表达沉默或PTEN靶序列的突变可以终止它们对PTEN的调控作用。3. miR-494和miR-22在细胞恶变中具有重要作用,是两个小分子原癌基因,能抑制细胞凋亡,增加细胞恶性程度。本项目创新性:发现了miR-494和miR-22的肿瘤学意义,并揭示了这两个miRNA对PTEN基因的调控作用。