可塑性是中枢神经系统(CNS)最突出的特点之一，不仅参与调解神经发育及再生，而且在增强突触功能与促进神经环路重建等方面也起到重要的作用。突触可塑性是学习和记忆的分子机制，突触可塑性是指那些因突触活力改变而引起神经递质释放发生变化的生理过程，普遍认为是突触的结构或者功能发生了变化，又称为突触结构可塑性及突触功能可塑性。对突触进行不同强度和不同频率的外界刺激可以引起突触兴奋性的改变，根据突触功能可塑性变化的性质不同,它可分为长时程增强(longterm potentiation, LTP)和长时程抑制(long term depression, LTD)。通过选择性地修饰位于活性区域的突触,使突触连接增强或减弱,从而参与学习和记忆活动。近年来，由于脑刺激在临床上被应用于治疗精神病及神经功能障碍方面，并取得较好的治疗效果，因此脑刺激方法作为一个可能的替代疗法而受到广泛关注。经颅磁刺激(TMS)能够利用导电线圈产生的脉冲磁场来影响被刺激脑区的电活动。这一时变磁场作用于不同脑区产生可传导性的感应电流，改变神经元兴奋状态，可以抑制或易化刺激位点及与其有突触联系的神经细胞的兴奋性，从而影响脑组织深部神经细胞功能活性的一项无创、无痛、非侵入性的脑研究手段。临床上，经颅磁刺激常用于治疗情绪、认知、感觉和运动神经系统等精神疾病患者，而重复经颅磁刺激多用于卒中、抑郁症、癫痫、阿尔茨海默病及帕金森病等疾病的恢复治疗，如书写痉挛，耳鸣和失语等。但经颅磁刺激的生物学机制尚未明确，可能通过诱导长时程增强(LTP)或长时程抑制(LTD)，进而对大脑皮层的兴奋性及突触的连接情况产生持续的影响。而且相关研究认为，可能通过交变磁场触发神经元动作电位、促进神经递质的释放，从而影响突触的结构和功能。通过调节突触功能和结构可塑性，rTMS可能诱发其他神经生理过程，如参与调节基因和蛋白的表达等。另外，施加磁刺激的强度、频率等参数，以及刺激方式都会导致不同的刺激效果。突触素(Synaptophysin, SYN)，生长相关蛋白43(growth-associatedprotein43，GAP43)和突触后致密物95(post synaptic density95，PSD95)是三种典型的突触相关蛋白。SYN和GAP43分布在突触前膜，PSD95位于突触后结构中。这些突触特异性蛋白标记物可以直接或间接地反映突触活性、突触形态变化及突触的生物学功能。大量研究表明，突触素在突触形成、突触联系建立及重建过程中具有重要作用；生长相关蛋白在形成新的突触连接过程、神经发育阶段及生长锥形成时期含量增加，而这些事件都伴随着轴突的生长，因此生长相关蛋白也呈现出高表达现象。突触后致密物(postsynaptic density, PSD)是位于突触活性区突触后膜下方与胞浆相连的一层致密电子结构，积极参与调节神经递质的分泌、积聚及相应受体的生物功能。而且近期关于突触树突棘相关基因研究的报道显示，新树突棘形成所需蛋白也要在突触后致密物中合成。突触后致密物95是突触后致密物复合物中的重要构成物质，通过与NMDA受体亚基的C末端结合调节细胞蛋白表达和酶的活性。相关研究证实，在体外培养条件下，给予人MO54细胞持续施加60Hz、5mT的磁刺激并作用12小时，能观察到生长相关蛋白转录水平及蛋白表达均有所增加；而在体实验研究表明6周的低频(0.5HZ)和高频(5HZ)重复经颅磁刺激均能引起大鼠脑内突触素蛋白转录和表达水平上升；并且通过磁刺激治疗可以提高中风后脑梗死区的突触素与生长相关蛋白的表达水平。这些研究证实磁刺激与突触蛋白标记物可能具有相关性，而这些突触相关蛋白可能与神经生长因子之间也存在某种联系。脑源性神经营养因子(BDNF, brain-derived neurotrophic factor)与其特异性酪氨酸激酶受体B (TrkB, Tyrosine kinase receptor B)结合后能够引起下游关键激酶的磷酸化，促进BDNF在神经元胞体和树突中的合成，进而激活信号转导通路，也可能BDNF在这些部位合成后被运送到突触前神经元后再发挥其调控功能，这两种可能都可以解释为BDNF的突触前调控机制。除此之外，BDNF还参与调节谷氨酸和GABA能突触的突触后神经递质受体的数量与分布，即突触后调控作用。未成熟的神经系统具有很高的可塑性，BDNF可以通过突触前、后的作用机制调节突触数量、突触功能以及树突形态。研究证实神经元的生理活动能够促进BDNF的转录合成，并将BDNF运送至树突并储存起来，而树突中BDNF的聚集又导致了突触活性的增强，从而调节突触可塑性。长期以来，大量研究发现在生长发育或神经再生不同过程中，BDNF具有对树突形态调节的多效性，基本得到公认的是BDNF可以增加树突的分支、扩大树突面积并使树突之间的联系复杂化。同时，BDNF与TrkB的结合引起TrkB的磷酸化，进而触发信号级联转导，激活三个主要的神经元的信号通路：丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(MEK/ERK信号)，磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/Akt和磷脂酶Cγ1(PLCγ1)的途径。这三条通路可能会分别产生不同的生理效应，但细胞的类型和培养条件以及刺激因素都有可能影响各信号通路的作用效果。目前，关于不同强度磁刺激对突触可塑性的研究较少，而且磁刺激对未成熟原代海马神经元突触结构可塑性的相关报道也较少，因此本研究观察海马神经元及突触形态的变化，以及磁刺激对突触相关蛋白和信号通路的影响，探讨不同强度的低频外界磁场干预对体外培养的神经元生长发育的影响并分析其可能机制，为临床上实施早期磁刺激干预提供理论依据。第一部分：磁刺激对原代海马神经元及突触形态的影响目的：观察低频(1Hz)磁刺激对原代海马神经元的生长情况及突触密度和突触超微结构的影响，研究磁刺激对突触结构可塑性的作用。方法：取胚胎15-17天(E15-17)的SWISS小鼠海马神经元进行体外培养，检测神经元纯度及细胞活力和凋亡情况。然后在培养第2天至第6天给细胞施加低强度磁刺激(LIMS,1Hz,1.14Tesla)和高强度磁刺激(HIMS,1Hz,1.52Tesla)，共连续刺激5天。于第7天，通过MAP2阳性标记细胞数与hochest33258标记的细胞总数之比鉴定神经元纯度；通过MTT法及流式细胞术测定磁刺激对神经元生存状态的影响；通过扫描电镜和透射电镜技术观察神经元和突触的超微形态，比较神经元突起的数目和长度以分析磁刺激对神经元形态的影响，应用体视学方法分析突触密度及突触超微结构的变化来反映磁刺激对突触形态的影响。结果：1.在体外培养第7天鉴定神经元纯度达90%；在培养第2天至第14天，神经元活力与凋亡率无明显变化，神经元保持良好的生存状态。2.磁刺激对培养7天的神经元活力与凋亡情况有不同影响：低强度刺激不影响神经元的生存状况，而高强度刺激显著降低神经元活力(P <0.05)并增加凋亡比率(P <0.01)。3.磁刺激对神经元形态的影响不同：高或低强度磁刺激均能促进神经元突起分支增加(P’s <0.05)，树突、轴突长度增长(P’s <0.05)，并建立更为联系紧密的体外神经网络，但这些现象在低强度组更为显著，而高强度组同时伴有细胞膜损伤或突起断裂的现象。4.磁刺激对突触形态的影响不同：不同强度的磁刺激均不影响突触间隙宽度及突触活性区长度，但能显著增加突触数密度、突触曲率和突触后致密物的厚度(P’s <0.05)；高强度刺激组突触数密度和突触后致密物厚度显著低于低强度刺激组(P’s <0.05)，同时高强度组表现出突触结构轮廓不清晰。结论：本实验所用体外培养方法适于海马神经元的生长，培养的细胞具有高活力与高神经元纯度的特点；低强度磁刺激不影响神经元生存状态，高强度刺激降低生存率、诱导凋亡；低强度刺激促进神经元发育、成熟，增加突触密度、增强突触活力，高强度刺激虽然也有促进生长发育的作用，但同时造成对神经元和突触结构的损伤。第二部分：磁刺激对原代海马神经元突触蛋白：突触素、生长相关蛋白43及突触后致密物95表达的影响目的：观察磁刺激对突触素、生长相关蛋白43及突触后致密物95转录水平及蛋白表达水平的影响，分析突触标志性蛋白与神经元、突触形态的关系，探讨磁刺激影响突触结构可塑性的物质基础。方法：通过细胞荧光免疫化学方法观察SYN, GAP43和PSD95蛋白免疫阳性产物在神经元胞体的表达部位，并运用PHOTOSHOP软件分析免疫反应阳性产物的荧光强度，基本确定阳性产物的细胞表达情况；通过western blotting技术进一步半定量分析SYN, GAP43和PSD95的蛋白水平；应用RT-PCR技术分析SYN, GAP43和PSD95的转录水平。结果：1. SYN, GAP43和PSD95的免疫荧光结果表明，SYN在神经元的细胞膜及树突呈点状分布，每一着色点体积较小；GAP43主要在细胞膜上呈片层状分布，阳性产物面积较大；PSD9在整个胞体和树突呈分散表达。荧光强度分析表明低强度刺激上调SYN (P＜0.05), GAP43(P＜0.01)和PSD95(P＜0.01)免疫阳性产物的表达，高强度刺激升高GAP43(P＜0.05)和PSD95(P＜0.05)阳性产物，但SYN阳性标记不仅未见升高反而低于低强度刺激组(P＜0.05)。2. Western免疫印迹与相对蛋白表达的分析结果与免疫荧光结果基本一致。低强度刺激显著升高SYN, GAP43和PSD95蛋白水平(P’s <0.01)，高强度刺激也升高了SYN, GAP43和PSD95蛋白水平(P’s <0.05),但SYN和PSD95的蛋白量显著低于低强度刺激组(P’s <0.05).3. RT-PCR结果与免疫荧光及蛋白半定量结果基本一致，高、低强度磁刺激均显著上调了突触蛋白的转录水平，而高、低刺激强度组之间无显著差异，此结果与蛋白结果并不一致。结论：磁刺激虽然不同程度地增加了SYN, GAP43和PSD95的转录水平及蛋白表达，但低强度刺激对SYN和PSD95蛋白的上调作用更为显著。提示，低强度刺激能够促进神经元突触发芽、构建神经网络、加速突触蛋白的合成，此强度利于神经元的生长发育；高强度刺激虽然也有促进生长的作用，但其造成对神经元及突触的损伤，可能引起突触回缩，降低突触素的表达，可能伴随有突触结构重建及神经元修复的发生。此外，本研究中，突触素的表达似乎与突触的形成关系更为密切，提示突触素可能是磁刺激诱导的突触数密度和突触结构变化的关键因素；GAP43和PSD95在本研究中兼具促进神经系统生长发育及发挥损伤后的神经保护作用，起到神经代偿性修复的意义。第三部分：磁刺激对原代海马神经元BDNF-TrkB表达及相关信号通路的影响目的：检测磁刺激对原代海马神经元BDNF-TrkB的转录调控与蛋白水平的影响，并测定BDNF-TrkB相关信号通路的表达情况。探讨神经元与突触结构变化及突触相关蛋白变化的可能调节因子，分析该调节因子在磁刺激调节突触结构可塑性过程的中继作用及可能机制。方法：首先通过免疫荧光化学方法及Photoshop软件测定磁刺激对BDNF与TrkB免疫阳性产物的分布与荧光强度。接着利用westernblotting和RT-PCR方法对BDNF与TrkB的表达进行半定量分析，并选取BDNF-TrkB下游MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路中的关键物质Akt,ERK和CREB及其磷酸化水平进行测定，确定磁刺激信号转入细胞核的可能途径。最后为明确磁刺激诱导的BDNF-TrkB通路与突触相关蛋白表达变化之间可能存在的联系，在细胞检测前4小时加入50nM的TrkB特异性抑制剂k252a，分析加入抑制剂前后SYN, GAP43和PSD95蛋白表达差异。结果：1.免疫荧光化学、western、RT-PCR结果显示，不同强度磁刺激均能显著上调BDNF与TrkB表达(P’s <0.01)。2.磁刺激显著升高p-AKT1, p-ERK1/2及p-CREB与total AKT1,ERK1/2及CREB蛋白水平的比值，提示磁刺激促进AKT1(P’s <0.01),ERK1/2(P’s <0.01)和CREB(P’s <0.05)的磷酸化。3. K252a显著降低SYN (P’s <0.01), GAP43(P’s <0.01)和PSD95(P’s <0.01)的蛋白量。结论：本研究中磁刺激上调BDNF与TrkB水平，通过BDNF与TrkB结合，激活下游PI3K-Akt和MEK-ERK信号通路，促进磷酸化的转录因子进入细胞核。K252a通过抑制TrkB，实现了降低突触蛋白表达的作用，提示SYN, GAP43和PSD95可能被BDNF-TrkB通路所调节。总之，上述实验从形态学观察、蛋白质定量分析、转录水平定量分析等不同层次开展实验，探讨了磁刺激对原代海马神经元生长情况及突触超微结构的影响、对突触标志性蛋白的影响，基本确定了磁刺激对突触结构可塑性的调控作用。本研究又进一步探讨磁刺激调节可塑性的可能调节因子，认为脑源性神经生长因子与其特异性酪氨酸激酶受体B可能担负这一中继功能。本研究表明，低强度刺激(1Hz,1.14T)引起SYN, GAP43和PSD95的增加，诱导神经元快速生长发育，高强度刺激(1Hz,1.52T)也使SYN, GAP43和PSD95有所升高，但对SYN的作用明显较弱，可能与突触结构损伤、突触密度降低有关，主要诱导GAP43和PSD95发挥神经保护作用，最终导致神经元及突触形态的变化。磁刺激上调BDNF与TrkB水平，通过BDNF与TrkB结合，激活下游PI3K-Akt和MEK-ERK信号通路，促进磷酸化的转录因子进入细胞核。而SYN, GAP43和PSD95可能被BDNF-TrkB通路所调节。上述过程完成了磁刺激信号由胞膜外传入核内的过程，最后引起基因表达模式的改变，促进SYN, GAP43和PSD95的蛋白质、DNA、RNA等物质合成，进而在生理学和形态学上应答BDNF对细胞的改变，完成调节神经元存活、发育分化等生物学功能。