细胞色素P450氧化酶(Cytochrome P450,CYP)是由一类与结构和功能相关的同工酶构成的亚铁血红素—硫醇盐蛋白超家族,广泛存在于自然界的生物体中。它参与内源性物质的氧化、过氧化以及还原代谢作用和包括临床上90%的药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。T-2毒素是单端孢霉烯族化合物中性质最稳定、毒性最强的毒素之一,广泛分布于玉米、小麦和食品添加剂中。喂食被T-2毒素污染的饲料能使畜禽中毒,严重者甚至死亡。毒素在畜禽体内的代谢物可以通过农副产品间接威胁到人类的健康。而猪是我国农场和消费市场占有量最大的动物之一,它更容易受到T-2毒素的污染和毒害。羟化反应是T-2毒素在动物体内发生的主要代谢反应之一,也是影响其毒性大小的关键反应之一。前期的研究发现,在猪体内,CYP 3A家族基因(CYP3A22、CYP3A46和CYP3A29)能催化T-2毒素或HT-2毒素发生羟化反应。其中CYP3A29催化T-2毒素羟化代谢成3’-OH-T-2的关键位点已经初步阐明,然而CYP3A22和CYP3A46的羟化代谢T-2毒素的关键位点尚不清楚。目的和手段:本研究将通过异源表达、纯化、计算机同源建模、分子对接、定点突变和活性检测等方法,在体外获得天然构象、稳定活性的猪的CYP 3A家族蛋白的基础上,特别是对CYP3A22和CYP3A46催化T-2毒素羟化代谢中的关键位点进行深入研究。结果:1、通过不同异源表达体系的摸索和优化,最终在体外哺乳动物细胞表达体系中获得了具有稳定催化T-2毒素羟化代谢能力的猪CYP3A家族蛋白;2、在猪CYP3A家族与T-2毒素分子对接的实验中,初步筛选出CYP3A22可能发挥羟化代谢的关键位点为Met-57、Arg-105、Arg-106、Ser-119、Arg-212、Phe-213、Asp-214、Phe-215、Ala-305、ILe-301、Thr-309、ILe-369、Ala-370、Ala-371、Arg-372、GLy-481和Ile-483这17个残基,其中Phe-213、Thr-309和Gly-481 3个残基多次与T-2毒素分子形成氢键。CYP3A46可能发挥羟化代谢的关键位点为Phe-108、Phe-304、Pro-371、Ala-305、Thr-370、Lys-212、Phe-215、Phe-213、Arg-372、Arg-106、Arg-105、Glu-374和Leu-373这13个残基,其中Lys-215、Phe-213和Glu-374 3个残基多次与T-2毒素分子形成氢键。3、对猪CYP3A46催化T-2毒素羟化代谢中的关键位点进行深入研究,发现F213A、F215A和E374A突变体羟化代谢T-2毒素能力丧失;R106A、F108A和T370A这三个突变体代谢能力下降非常显著;突变体K212A代谢产物量也有减少,约为野生型的75%。以上结果提示Arg-106、Phe-108、Phe-213、Phe-215、Thr-370和Glu-374是影响T-2毒素羟化代谢的关键位点,Lys-212可能是影响T-2毒素进入活性区域的位点。