论文部分内容阅读
目的(1)探讨成体骨髓间充质干细胞的体外培养方法并研究培养细胞的生物学行为特征,建立体外分离培养MSCs程序方法,为进一步实验和临床应用提供基础;(2)利用绿色荧光蛋白基因作为示踪剂,观察MSCs对大鼠脑胶质瘤的趋向性,以明确MSCs能否作为肿瘤基因治疗的载体;(3)探讨颅内移植IL-4基因修饰的MSCs对大鼠脑胶质瘤的治疗效果。方法(1)采用梯度离心法分离大鼠骨髓基质细胞,24h后换液,保留贴壁细胞,体外培养扩增,光镜下观察细胞形态特点,传代培养后免疫细胞化学技术鉴定细胞表面CD44,CDl05和CD45的表达,分别在特定条件下进行成骨、脂肪和神经细胞的诱导分化,分别鉴定诱导后细胞碱性磷酸酶、油红0和神经元特异性烯醇化酶的表达;(2)脂质体介导EGFP基因转染MSCs,G418筛选,荧光显微镜下观察基因转染的情况,同时立体定向方法建立大鼠C6脑胶质瘤模型,分别行HE染色和免疫组织化学鉴定肿瘤组织GFAP的表达,并将EGFP标记的MSCs原位种植到大鼠脑胶质瘤模型中,2周后取出脑和肿瘤组织,制成切片,在荧光显微镜下观察绿色荧光的分布情况;(3)脂质体介导mIL-4基因转染MSCs,G418筛选,转染后采用ELISA检测培养细胞上清中mIL-4的分泌,RT-PCR检测mIL-4 mRNA的表达水平,将稳定转染mIL-4并经BrdU标记的MSCs颅内原位种植于荷C6脑胶质瘤大鼠,分别以PBS和未转染基因的MSCs作为对照组。观察治疗后动物生存状况、磁共振扫描观察肿瘤大小、H-E染色观察肿瘤组织学变化,免疫组化鉴定CD4、CD8、mIL-4及BrdU的表达。结果(1)刚接种的骨髓基质细胞呈圆形,悬浮生长,24h后可见散在贴壁细胞,此后逐渐增多并变为长或宽扁的梭形,免疫化学显示多数细胞为CD44,CD105阳性染色,而CD45为阴性,细胞在体外可以定向诱导分化为成骨、脂肪和神经元样细胞;(2)EGFP基因在体外可以稳定转染MSCs,阳性细胞在荧光显微镜下显示为绿色荧光,HE染色和免疫组化证实大鼠颅内肿瘤为胶质源性肿瘤,表现为GFAP阳性,EGFP标记的MSCs原位移植后弥散分布于肿瘤组织以及肿瘤与脑组织交界处;(3)MSCs转染后可稳定表达mIL-4,1.Oxl06细胞培养24h可分泌mIL-465.78±2.28np/ml,RT-PCR在转基因组可检测到mIL-4 mRNA表达,而对照组未检测到,BrdU标记的MSCs移植后弥散分布于肿瘤内部及边缘,MSCs-mIL-4治疗组生存期明显延长,肿瘤体积(mm3)明显小于各对照组(55.08±5.14vs.227.72±10.23,279.54±18.84,P<0.01),肿瘤局部可出现坏死改变,并有CD4+和CD8+细胞浸润,免疫组化在治疗组可检测到mIL-4蛋白的表达。结论(1)MSCs在体外易于培养和扩增,并可以向多种组织分化;(2)外源性基因可在体外转染MSCs;(3)MSCs对大鼠脑胶质瘤具有趋向性;(4)mmIL-4基因修饰的MSCs对大鼠脑胶质瘤有良好的靶向性和治疗效应;(5)MSCs作为治疗载体是脑胶质瘤治疗的有力工具。