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伊立替康(Irinotecan,CPT-11)主要用于出现转移或应用标准的氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)治疗后失败的进展期结直肠癌患者。然而,仅有30-55%患者对伊立替康的治疗方案有效,且5年存活率小于10%。耐药是限制结直肠癌患者疗效的主要因素之一。Twist1基因是一种高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子,在细胞的上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)、多药耐药(multidrug resistance,MDR)、肿瘤的侵袭转移、细胞增殖分化形成等方面发挥重要的作用。我们前期研究发现,Twist1高表达是结肠癌患者不良预后的独立危险因素之一,并且在结肠癌细胞多药耐药和侵袭转移中发挥重要作用。然而,由Twist1介导的结肠癌伊立替康多药耐药形成及其恶性生物学行为的作用机制仍不清楚。目的1.通过构建结肠癌伊立替康耐药细胞株,分析评价结肠癌耐药细胞的恶性生物学特性;2.探讨Twist1介导结肠癌伊立替康多药耐药形成及其恶性生物学行为的作用机制。方法第一部分人结肠癌伊立替康耐药细胞株的构建、评价及其恶性生物学特性采用药物浓度递增法构建人结肠癌伊立替康耐药模型LoVo/CPT-11R细胞株,光镜下观察细胞形态学改变;CCK-8法检测耐药细胞生存率变化,计算耐药指数(Resistant index,RI),并分别检测细胞耐药前后对不同药物(CPT-11、5-FU、顺铂(Cisplatin,DDP)及姜黄素(Curcumin,Cur))生存率的变化;细胞免疫荧光法检测耐药细胞EMT分子标志物细胞定位;qRT-PCR、Western blot法分别检测耐药细胞多药耐药基因、EMT分子标志物、转录因子、CSC分子标志物在mRNA及蛋白质水平表达变化。第二部分Twist1介导结肠癌伊立替康多药耐药形成及其恶性生物学行为的作用机制采用慢病毒转染法构建Twist1稳定过表达的人结肠癌LoVo/Twist1细胞株;采用siRNA干扰技术抑制LoVo细胞和LoVo/CPT-11R细胞中Twist1的表达。CCK-8法分别检测Twist1过表达前后和抑制表达前后其对伊立替康敏感性变化;Transwell实验检测LoVo/Twist1细胞侵袭迁移能力的变化;同前方法检测EMT、CSC标志物及MMPs、ABC转运蛋白等目的基因表达变化。结果第一部分1.LoVo/CPT-11R细胞能在含70 μg/mL伊立替康的全培中稳定生长,耐药指数为5.79;细胞体积明显增大,长梭形纤维状细胞增多,生长弥散无规律。2.不同浓度CPT-11、5-FU、DDP、Cur处理细胞后,LoVo/CPT-11R细胞的生存率均明显增加;在mRNA和蛋白质水平,ABCB1(P-gp)表达明显上调。3.LoVo/CPT-11R细胞中E-cadherin蛋白更多表达于细胞质,更少表达于细胞膜,位于细胞骨架的Vimentin蛋白表达明显增加;在mRNA和蛋白质水平,EMT标志物中E-cadherin、ZO-1 下调,Vimentin、N-cadherin上调;转录因子中Twist1表达上调;CSC标志物中CD44、CD133表达均上调。第二部分1.过表达Twist1的LoVo细胞对伊立替康的敏感性降低;在蛋白质水平,CD44表达上调,E-cadherin下调。2.过表达Twist1的LoVo细胞侵袭、迁移能力显著增强;MMP2蛋白表达上调。3.抑制Twist1的表达后LoVo细胞对伊立替康的敏感性增加,并逆转LoVo/CPT-11R细胞对伊立替康的耐药。4.抑制Twist1的表达可以下调ABCB1(P-gp)、Vimentin、CD44的表达。结论第一部分1.人结肠癌伊立替康耐药细胞具有多药耐药特性,并且与ABCB1(P-gp)的高表达有关;2.人结肠癌伊立替康耐药细胞发生EMT、CSC样表型改变,且Twist1上调。第二部分1.Twist1介导的EMT、CSC样表型改变诱导结肠癌伊立替康耐药形成;2.Twist1介导ABCB1及MMP2的上调促进结肠癌细胞伊立替康耐药及增强侵袭迁移能力。