目的:骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是临床上最常见的骨原发性实体恶性骨肿瘤,主要起源于骨,极少数情况下起源于软组织。骨肉瘤以出现制造骨样组织或不成熟骨的恶性间叶细胞为特点,好发于儿童和青少年,另外在年龄约50岁的人群中有第二个发病小高峰,男性发病率是女性的1.4倍,总体年发病率约为2-3/100万。20世纪80年代以来,随着化疗及手术相结合的多模式治疗方法的引入,骨肉瘤患者的5年生存率由过去的不足20%提升到了60-70%,但是直到现在的几十年内该生存率未能再有进一步的提高。造成这一现状的因素是多方面的,其中主要的原因是化疗不敏感、耐药、复发、转移等,因而寻求新的治疗方法或者新的治疗药物来克服这些困难、提高骨肉瘤的治疗效果、改善患者的预后尤为迫切。大量的研究证明在包括骨肉瘤在内的多种肿瘤中,肿瘤干细胞是存在的,其在肿瘤的耐药、复发、转移中发挥着重要作用。DMAMCL是一种我国近年自主研发的新型抗肿瘤药物,是由其前体成分MCL通过马克尔加成反应合成的愈创木酚倍半萜内酯衍生物。已有研究证明DMAMCL在急性髓细胞性白血病及神经胶质瘤、横纹肌肉瘤等非实体和实体性肿瘤中均显示出较好的抗肿瘤作用,同时其有效成分对肿瘤干细胞、耐药肿瘤细胞具有选择性的抑制作用。针对成人脑神经胶质瘤,该药物在澳大利亚及中国已进入I期临床试验阶段(ANZCTR-ACTRN12618001934235,ChiCTR-OIC-17013604)。目前尚无DMAMCL在骨肉瘤中的研究报道。本项研究通过探讨DMAMCL在体内、体外对骨肉瘤的抗肿瘤作用及其机制,以期寻找治疗骨肉瘤的新药物,为DMAMCL在骨肉瘤治疗的临床应用提供理论基础和依据。研究方法:1.细胞系及细胞培养:本研究使用5个骨肉瘤细胞系(MNNG,MG63,Saos-2,U-2OS,143B),一个小鼠成纤维细胞系NIH3T3和一个人视网膜上皮细胞系ARPE-19。细胞培养液:DMEM高糖培养液+10%FBS+抗生素(青霉素和链霉素混合液,工作浓度100U/ml)+谷氨酰胺(2mmol/ml),143B细胞在培养过程中按0.015mg/ml加入5-溴-2-脱氧脲苷。细胞培养于37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱内。2.细胞存活检测:在体外实验中利用MTS方法检测细胞存活,应用Incucyte活细胞动态成像系统动态监测细胞融合率来间接反应细胞增殖情况。3.细胞周期及细胞凋亡检测:体外实验中,利用流式细胞仪对用PI(碘化丙啶)染色后的细胞进行细胞周期的检测、对用Annexin V和PI双染色后的细胞进行细胞凋亡检测,同时利用Hoechst 33342细胞核染色检测细胞凋亡;利用Caspase-Glo 3/7 Assay检测试剂盒检测药物处理前后细胞凋亡相关Caspase3/7分子活性变化。体内实验中,利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测小鼠种植肿瘤组织中的细胞凋亡。4.肿瘤细胞干性检测:通过克隆形成实验和干细胞成球实验间接反映骨肉瘤细胞干性的变化,应用Image J软件进行分析。5.目的蛋白检测:应用Western Blot方法检测细胞及肿瘤组织中与细胞凋亡及细胞周期、细胞干性相关蛋白的表达。6.目的基因的沉默表达:利用小干扰siRNA转染技术沉默细胞中Bax的表达,进而研究其在DMAMCL对骨肉瘤细胞作用机制中的功能。7.体内实验:将骨肉瘤细胞系(143B,MG63)种植于裸鼠皮下,待种植瘤长到100mm~3大小给予不同剂量的DMAMCL治疗,比较不同组间肿瘤的生长及小鼠的生存情况。8.统计分析:使用统计学软件SPSS 22.0对实验数据进行统计学分析,体外实验的数据以均值±标准差(`X±SD)表示,小鼠体内实验的数据以均值±标准误(`X±SE)表示。两组间差异的比较采用t检验方法,P<0.05则认为所得出的实验数据差异具有统计学意义。小鼠多组间生存分析实验数据采用对数秩检验(Log-Rank test),P<0.05则认为所得实验数据差异具有统计学意义。实验数据曲线图表采用GraphPad Prism 7或Adobe Photoshop2019软件绘制。结果:1.DMAMCL诱导骨肉瘤细胞的死亡:在体外实验中,5个骨肉瘤细胞系(143B,MNNG,MG63,Saos-2,U-2OS)和对照组的非肿瘤细胞系(NIH3T3、ARPE-19)给予不同浓度DMAMCL处理72小时后,以MTS方法检测细胞的存活情况,结果显示:DMAMCL在骨肉瘤细胞中引起浓度依赖性的细胞死亡,IC50(半抑制浓度)范围从11.73到13.16μM;而非肿瘤细胞系NIH3T3细胞的IC50是34.64μM,ARPE19细胞的IC50是42.01μM,分别约为骨肉瘤细胞的3倍和4倍,对DMAMCL的敏感性明显较骨肉瘤细胞低。同时利用Incucyte活细胞动态成像系统实时检测骨肉瘤细胞融合率的变化,进而反应细胞增殖情况,结果与MTS检测的细胞存活结果相一致。2.DMAMCL在体内抑制骨肉瘤的肿瘤生长:在体内研究中,对接种骨肉瘤细胞(143B,MG63)种植瘤的裸鼠每天给予DMAMCL治疗(75mg/kg和100mg/kg),共持续21天,定期测量肿瘤大小。结果显示:DMAMCL能够引起剂量依赖性的肿瘤生长抑制:在治疗21天结束时,75mg/kg和100mg/kg治疗组的平均肿瘤体积分别为对照组的:70.69%和48.01%(143B细胞种植瘤),83.26%和64.29%(MG63细胞种植瘤);其中在两种细胞系的种植瘤中,100mg/kg治疗组与对照组的差异均具有统计学意义。3.DMAMCL延长骨肉瘤荷瘤鼠的生存时间:为了研究DMAMCL对骨肉瘤荷瘤鼠生存时间的影响,我们对接种了骨肉瘤细胞(143B,MG63)种植瘤的裸鼠给予DMAMCL(75mg/kg,100 mg/kg)治疗,记录所有鼠的生存时间,并进行Kaplan-Meier生存曲线分析,结果显示:DMAMCL治疗组的荷瘤小鼠表现出了更明显的生存优势,两个不同剂量DMAMCL治疗组的小鼠生存时间均较对照组延长,且差异具有统计学意义。在143B荷瘤鼠中,对照组、DMAMCL 75mg/kg治疗组及100 mg/kg治疗组的中位生存时间分别为18天、24天(P=0.0417)和29天(P=0.0118);在MG63荷瘤鼠中,分别为29天、37天(P=0.0026)和37天(P=0.0039)。4.DMAMCL阻滞骨肉瘤细胞的细胞周期于G2/M期:对骨肉瘤细胞(143B,MNNG,MG63,Saos-2,U-2OS)给予不同浓度的DMAMCL处理,利用流式细胞术进行细胞周期检测,结果显示:随着浓度的增加,G2/M期的骨肉瘤细胞比例明显升高。DMAMCL处理后,143B细胞中的G2/M期细胞升高的比例最大为13.73%,MG63细胞中为19.76%,MNNG细胞中为10.50%,Saos-2细胞中为10.05%,U-2OS细胞中为22.49%。利用Western Blot检测调控G2/M的关键分子,结果显示DMAMCL处理后细胞周期相关蛋白CyclinB1的表达增加,而CDC2的表达下降。5.DMAMCL抑制骨肉瘤细胞的干性:骨肉瘤细胞(143B、MG63或MNNG)给予DMAMCL处理之后,利用Western Blot检测细胞干性标记分子CD133和Nanog的表达,利用克隆形成实验及干细胞成球实验进一步检测细胞的干性。结果显示在三个细胞系中CD133和Nanog的表达水平均明显降低;在143B和MG63细胞中,DMAMCL明显抑制细胞的克隆形成能力:143B细胞中DMAMCL处理组的克隆数为对照组的30.58%(P<0.05),在MG63细胞中为32.11%(P<0.01);在143B和MNNG细胞中,DMAMCL明显抑制干细胞成球能力:143B细胞中DMAMCL处理组的干细胞成球数为对照组的29.62%(P<0.01),在MNNG细胞中为12.05%(P<0.01)。6.DMAMCL在体内、体外诱导骨肉瘤细胞凋亡:体外实验检测细胞周期结果显示,随着DMAMCL处理浓度的增加,Sub G1期的骨肉瘤细胞的比例增加。对DMAMCL(10μM、20μM、30μM)处理了24h的骨肉瘤细胞(143B、MG63、Saos-2)给予Annexin V/PI染色,利用流式细胞术检测凋亡细胞,结果显示:DMAMCL处理后三个细胞系中早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例均呈剂量依赖性增加,其中143B细胞的早期凋亡细胞比例由1.45%(0μM)增加到21.25%(30μM),MG63细胞由3.03%(0μM)增加到50.75%(30μM),Saos-2细胞由8.37%(0μM)增加到16.85%(30μM)。对DMAMCL处理了24h的骨肉瘤细胞进行Hoechst 33342染色显示发生核固缩和核碎裂的细胞明显增加。同时Caspase-Glo3/7 Assay检测结果显示DMAMCL处理后的骨肉瘤细胞的Caspase3/7活性明显增加;Western Blot检测结果显示DMAMCL处理后的骨肉瘤细胞中cleaved-PARP表达水平升高,Bcl-2家族成员中的促凋亡分子Bax和Bak表达升高,抑凋亡分子Bcl-2和Mcl-1表达降低。在体内实验中,TUNEL染色检测凋亡细胞结果显示与对照组相比,DMAMCL治疗组的骨肉瘤组织中,TUNEL染色阳性的细胞(凋亡细胞)数量明显增加;Western Blot检测结果显示cleaved-PARP的蛋白表达水平明显升高。这些结果提示:DMAMCL能够在体内和体外引起骨肉瘤细胞的凋亡。7.Bax介导DMAMCL诱导的骨肉瘤细胞死亡:将Bax siRNA(#1、#2)转染进入骨肉瘤细胞(143B、MG63)后,给予DMAMCL处理,Western Blot检测结果显示,在143B细胞和MG63细胞中,转染Bax si RNA(#1,#2)均可阻断DMAMCL诱导的Bax表达水平的增加;MTS检测结果显示,与DMAMCL单独处理组相比,DMAMCL+Bax-siRNA处理组的骨肉瘤细胞的存活率明显增加:在143B细胞中,DMAMCL处理组为19.85%,DMAMCL+Bax-siRNA#1处理组为46.45%,DMAMCL+Bax-si RNA#2处理组为28.76%;在MG63细胞中,DMAMCL处理组为37.12%,DMAMCL+Bax-si RNA#1处理组为50.44%,DMAMCL+Bax-siRNA#2处理组为53.04%,且差异具有统计学意义。这些结果提示Bax介导了DMAMCL诱导的骨肉瘤细胞死亡。结论:1.体外实验中,DMAMCL引起敏感性明显高于非肿瘤细胞的剂量依赖性的骨肉瘤细胞死亡,同时具有使骨肉瘤细胞阻滞在细胞周期的G2/M期和抑制骨肉瘤细胞干性行为的作用。2.体内实验中,DMAMCL作为单一药物能够抑制小鼠骨肉瘤种植瘤的生长,并且延长荷瘤小鼠的生存时间。3.DMAMCL在体外和体内均能通过诱导细胞凋亡的发生引起骨肉瘤细胞的死亡。4.Bax介导了DMAMCL引起的骨肉瘤细胞死亡。