Study on the Preparation and Properties of Nannochloropsis Calcium-chelating Peptide

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本论文分析了微拟绿球藻Nannochloropsis oceanica的主要成分,Nannancholoropsis oceanica蛋白来源丰富,易于获得且价格低廉。微拟球藻是良好蛋白质来源。有很多方法可以从样品中提取蛋白质,其中超声辅助提取研究应用广泛。适度超声辅助提取可提高提取效率,并提高产品质量,同时减少溶剂消耗和时间。天然制备的钙结合肽可有效替代合成药品。Nanocholoropsis蛋白是制备钙螯合肽的较好原料。钙离子可以与肽/氨基酸之间的相互作用形成螯合。首先通过单因素试验以螯合活性、螯合率和收率为指标对超声波功率、质量比、超声波时间、超声波温度和氢氧化钠浓度等条件进行了螯合条件优化。钙螯合肽初步鉴定采用茚三酮显色法。采用不同的酸碱度、高温加热、体外模拟胃肠道消化和PBS缓冲液对钙离子螯合肽的稳定性进行了研究。然后通过紫外光谱、荧光光谱、FTIR、Zeta电位、TG-DCS和X射线分别对螯合物进行表征。最后用SEM和AFM对多肽和钙结合多肽进行了形态分析,并对钙螯合肽进行氨基酸和分子量分布分析,主要研究结论如下:(1)首先优化获得微拟球藻蛋白的最佳提取工艺条件;提取温度40℃,时间60分钟,超声波功率800W,料液比1:50 g/m L,Na OH浓度0.4M,此条件下蛋白提取率94.81±0.151%,粗蛋白得率51.69±0.0121%,提取物中蛋白纯度76.86±0.0191%。然而,传统碱提3h微藻蛋白提取率只有60.02±0.01%。超声提取蛋白提取率高34.79%,提取时间节约三分之二。(2)研究了蛋白的不同理化性质,如起泡能力,起泡稳定性随p H值的升高呈增加趋势,吸水能力随p H值的升高变化。蛋白质的吸油能力在p H值为11时为96.8%,而等电点为p H3.5。当p H大于6时,微绿球藻蛋白溶解度大于97.94±0.015%。蛋白的理化性质表明,p H值的变化对其性质产生显著影响。等电点的溶解度、OAC、WAC、FC和FS最小。微藻的功能特性主要与它们的理化特性有关。因此,利用适宜条件提取微拟球藻蛋白可以用于食品工业,并有可能取代许多合成产品(3)形成钙螯合物的最佳条件:料液比9:1,螯合时间15min,螯合p H 9,温度40℃,功率1000W,此条件下钙螯合率为61.89±0.121%,钙螯合活性为9.08±0.151%,钙螯合物得率为65.57±0.190%。(4)通过Ca螯合物在不同浓度的PBS缓冲液、加热温度、p H水平和体外模拟消化稳定性分析表明,螯合物稳定性较好。经胃液模拟消化30分钟,Ca肽的保留率为81.93±0.00761%,胰蛋白酶消化进一步降低了钙离子保留率。钙螯合肽在p H高于6时均较稳定。Ca螯合肽的稳定性受温度影响较小,在磷酸盐缓冲液浓度较低(10mmol/L)时,螯合物稳定。(5)FTIR光谱显示了螯合物的存在,紫外光谱扫描、荧光光谱、ζ电位、粒度分布和氨基酸分析不仅证实了螯合物的产生,并且不同的光谱分析和检测信号还表明金属离子与微藻肽中的氨基、羧基和其他活性螯合基团形成金属螯合物。(6)SEM和AFM图像显示了螯合肽的致密结构。分析结果表明,微藻多肽-金属离子螯合物应该是通过螯合产生的新物质。
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