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樟芝菌,又名牛樟芝,是我国台湾特有的珍稀食用和药用真菌,可产三萜、多糖、甾醇、苯环类化合物等多种活性成分;樟芝培养物具有保肝、抗癌、调节免疫力、抗炎症等药理活性。近年来,许多学者研究发现,樟芝菌丝体产物具有与子实体相近的药理活性功能。同时,樟芝菌丝体产物中鉴定出的Antrodins和Antroquinonol类化合物,在保肝、抗癌方面具有卓越的疗效。但是目前关于樟芝菌丝体产物中特征活性成分系统的鉴定分析较少,使得樟芝菌丝体产物的发酵调控缺乏目标性,产物的质量控制也不明确。大多数的发酵研究都是关于多糖、菌体量等非特征性活性产物,使得樟芝菌丝体产物的品质始终处于较低水平,市场竞争力差。本课题的目的是通过对樟芝菌丝体产物活性成分较为全面的鉴定解析,从中筛选出樟芝菌丝体产物的指标化合物,对来源不同的樟芝发酵产物HPLC图谱进行了对比分析;根据筛选出的指标化合物,对樟芝固态发酵和液态发酵两种人工培养方法进行优化,研究工艺条件和产物后处理方式;针对液态发酵产物的不足,建立高通量生产樟芝活性产物的耦合发酵方法,为樟芝的进一步推广打下基础。本课题主要研究结果如下:(1)利用柱层析、制备HPLC等技术,对樟芝发酵产物中的活性成分进行了鉴定解析。从樟芝产物中纯化出8个化合物,经质谱、核磁等手段分析,这8个化合物分别为:Ergostatrien-3β-o(lAC-1);Antrodin C(AC-2);Antrodin B(AC-3);Antrodin A(AC-4);Antroquinonol ( AC-5 ) ; Antroquinonol B ( AC-6 ) ;4,7-Dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole(AC-7);Ubiquinone-3(AC-8)。(2)对来源不同的樟芝发酵产物HPLC图谱进行了对比分析。通过分析可知,无论是樟芝固态发酵还是液态发酵产物,其活性物质与樟芝子实体还是有一定的差异,但是也有其自身的特点。樟芝液态发酵产物,其主要活性成分为Antrodins类化合物,尤其以Antrodin C含量最高。樟芝固态发酵产物,其主要活性成分为Antrodins类和Antroquinonol类化合物,各组分的含量较为均衡。(3)对樟芝固态发酵过程中影响Antrodins的因素进行了优化。实验确定的最适培养基(/1 L锥形瓶)为:大米100 g,黄豆粉0.6 g,K2HPO4 0.05 g,MgSO4 0.05 g。培养基初始含水量为52%,接种量为35%(v/m),培养24 d。发酵过程温度采用变温调控,第一阶段培养温度为28℃,培养16 d后将发酵温度调整为25℃继续培养8 d。在最佳培养条件下,樟芝固态发酵产物中Antrodin A-C的含量高达3096.9 mg/kg、6876.7 mg/kg和8095.7 mg/kg。(4)利用Plackett-Burman design和Box-Behnken响应面分析法,优化了樟芝液态发酵培养基成分对Antrodin C产量的影响,并建立了模型。得到最优液态发酵培养基为:葡萄糖72 g/L、黄豆粉5.91 g/L、MgSO4 0.614 g/L,樟芝液态发酵培养基理论上产Antrodin C的最大值178.59 mg/L。根据上述回归分析结果和响应面实验特点,在实验水平内安排验证实验,发酵7 d后实际产Antrodin C为177.83±0.32 mg/L,该模型能较好地预测实际产Antrodin C情况。(5)研究了樟芝液态发酵过程中高溶氧对樟芝活性产物Antrodin C合成的影响。结果显示,三种方式均可以在发酵中后期大幅度提高发酵液溶氧水平,从而提高Antrodin C产量。其中添加氧载体十二烷、流加过氧化氢是较适合樟芝液态发酵的方式。(6)考察调节细胞通透性对樟芝产Antrodin C的影响。添加0.3%M,胞外Antrodin C含量从41.72%提高到74.60%;摇瓶实验中,在发酵第4 d添加0.5%M,Antrodin C产量高达322.17 mg/L,比对照提高了84.03%。(7)将调解细胞通透性与原位萃取相结合,提出了能有效提高樟芝液态发酵生产Antrodins和Antroquinonol类化合物的原位萃取发酵技术。优化的耦合发酵体系为:在发酵第4 d添加0.7%表面活性剂M,之后在第5 d加入10%原位萃取剂十二烷,同时在发酵第4 d开始流加0.15 mmol/L/h过氧化氢提高发酵液溶氧。通过耦合发酵,Antrodin C总含量高达455.78 mg/L,而十二烷萃取相中Antrodin C和Antroquinonol的含量分别高达2624.42 mg/L、489.09 mg/L,(8)对樟芝菌丝体产物的一般性成分进行了分析,实验结果表明,樟芝产物含有丰富的高级脂肪酸、氨基酸、腺苷、活性多糖等营养功能成分,并且在发酵过程中能产生丰富的挥发性香气成分。