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过敏反应在临床上经常发生,严重时可致人死亡,尤以中药注射液、注射用药用辅料、β-内酰胺类抗生素等药物最为突出,经研究发现,这些药物中残留的大分子蛋白可引起过敏反应,故为了保证用药安全,去除这些杂质是非常重要的,药品生产者也通过不断的技术改进尽量去除这些大分子蛋白杂质,因此需要建立一个灵敏度高、选择性好的方法对生产工艺进行验证和监测。然而由于这些药物生产过程复杂,大分子蛋白在生产过程中可能发生一系列的聚合、裂解等反应,故不适合用基于抗体-抗原反应的检测特异性活性蛋白的免疫法对其进行测定,也不适合使用基质影响大、灵敏度低的传统的光谱法对其进行检测,故建立一个准确度高、特异性好、灵敏度高的蛋白检测方法是药物分析者面临的一个难题。中药注射液中的植物蛋白等大分子杂质易随提取过程残留到终产品中,本文以茵栀黄注射液为研究对象,针对中药注射液成分复杂但大多是小分子这一特性,利用根据分子量大小对化合物进行分离的高效凝胶排阻色谱法(HPSEC)分析技术对其中的大分子蛋白含量进行了研究,为了进一步提高灵敏度,优选了检测波长,选取蛋白吸收更高的末端吸收作为检测波长。色谱柱为TSK gel SuperSW2000色谱柱(4μm,4.6×300 mm),流动相为磷酸盐缓冲溶液,流速为0.3 mL/min,紫外检测波长为220 nm,样品溶液经过滤后可直接进样,结果该方法在0.312-40.0μg/mL线性范围内关系良好(R~2=0.999),回收率均大于81%,重复性良好,RSD为0.6%,检测限可以达到0.104μg/mL,灵敏度比常用的测定蛋白的灵敏度最高的方法考马斯亮蓝法(Bradford)还提高了10倍左右,且只对样品进行简单处理即可进行分析,结果表明,该方法操作简便快速,重现性好,为其他同类药物中的大分子杂质的检测提供了一种可借鉴的分析手段。注射用乳糖是注射用药物生产中一种很好的药用辅料,但是由于乳糖来源于动物乳清,可能会残留有微量乳清蛋白引起过敏反应,故需要对其中的乳清蛋白进行严格控制。本研究同时建立了HPSEC法和超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF)两种方法对乳糖中的α-乳白蛋白及β-乳球蛋白进行检测,HPSEC法使用的色谱柱为TSK gelSuperSW2000色谱柱(4μm,4.6×300 mm),流动相为磷酸盐缓冲溶液,流速为0.3 mL/min,紫外检测波长为220 nm,结果该方法在α-乳白蛋白和β-乳球蛋白总浓度3.40~68.0μg/mL的范围内线性关系良好,回收率均大于87%,重复性良好,RSD为0.5%,检测限为1.13μg/mL,结果表明本研究建立的HPSEC法灵敏度较UPLC-Q-TOF法稍高,且该方法操作简单快速,成本相对较低,适用性更广,易于普及,但由于α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分子量接近,在HPSEC色谱柱中不能完全分离,故不能分别对二者进行定量,只能测定二者含量总和。UPLC-Q-TOF法以0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液和0.1%TFA乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,经蛋白柱分离后,采用飞行时间质谱检测器(TOF)进行全离子扫描模式检测。应用Peakview 1.2分析软件,通过对化合物离子精确质荷比、特征二级质谱以及保留时间的比对,对目标物进行验证。α-乳白蛋白和β-乳球蛋白测定的线性范围分别在2.00~80.0μg/mL和6.00~240.0μg/mL之间,相关系数为0.997和0.996;检测限分别为1.00μg/mL和3.00μg/mL;加样回收率分别为82.9%~87.2%和96.1%~98.4%。结果表明,本方法特异性好,结果准确,但对蛋白直接测定灵敏度并不高。故在实际检测中,若需要操作简单快速,成本较低,灵敏度高且需对两种蛋白总和进行检测时可选用HPSEC法;若需要对蛋白特异性要求较高,对蛋白分别进行鉴定和检测且灵敏度要求不高时可采用UPLC-Q-TOF;若需要对蛋白特异性要求较高且灵敏度要求也较高时,可对UPLC-Q-TOF法前处理进一步研究,使大分子裂解成分子量较小的化合物再进行检测。青霉素类等β-内酰胺类抗生素因其发酵工艺,易产生并残留大分子蛋白,本研究以青霉素V钾为模型药物,建立了一个中空纤维离心超滤(HFCF-UF)装置对蛋白大分子进行分离和富集,然后经末端吸收的HPSEC法对大分子进行分析测定。色谱柱为TSK gel SuperSW2000色谱柱(4μm,4.6×300 mm),流动相为磷酸盐缓冲溶液,流速为0.3 mL/min,紫外检测波长为220 nm,样品溶液经HFCF-UF一步离心富集可直接进样,并对非特异性吸附(NSB)现象进行了考察。结果该方法富集倍数高达99倍,回收率均大于87%,基本消除了NSB现象,经HFCF-UF富集处理后,可成功检测到样品中低至30.3 ng/g的大分子蛋白。结果表明,本方法操作简便,结果准确,灵敏度高,可满足生产者在生产过程中对大分子蛋白的监控需求,同时也为同类药物中的大分子蛋白检测提供了有效手段。