背景乙型肝炎根据临床表现不同,在中医范畴中常被归为“胁痛病”、“黄疸病”、“积聚病”等[1],其病机虽然错综复杂,但湿热疫毒侵袭、肝脾肾脏虚损、气血功能紊乱和脏腑功能失调是其主要病机特点,中药珍珠草复方正是针对这一病机特点,合理组方而成的。珍珠草又名叶下珠,为大戟科植物Phyllanthus urinaria L.药用全草。具有清热利尿、平肝明目、消积、解毒、止泻的功效。近年来用于治疗乙型肝炎,取得良好功效。以珍珠草为君药的珍珠草复方的组成药物主要有：珍珠草、黄芪、山慈菇、半枝莲等。主要功效为：健脾护肝、解毒消瘀、平衡阴阳。临床观察发现该方能有效阻断乙型肝炎发展为肝癌,并对原发性肝癌具有一定的治疗作用。本文通过体外研究模型(原代鸭胚肝细胞模型和HepG2.2.15细胞模型),对其抗乙肝作用进行了验证,并在HepG2.2.15细胞株上检测了该方对细胞凋亡的影响和对乙肝病毒癌基因HBV-X基因及趋化因子IP-10的影响,对该方阻断癌前病变,防治原发性肝癌的发生、发展的作用机理进行了初步探讨。材料和方法本文采用PCR法对先天感染鸭乙肝病毒的阳性鸭胚进行筛选；通过镜检法和MTT法对先天感染鸭乙肝病毒(DHBV)的原代鸭胚肝细胞的培养条件进行了摸索；通过荧光定量PCR法,观察了该方对原代鸭胚肝细胞的毒性作用和该方对DHBV-DNA表达的影响。采用了台盼蓝染色法检测该方对HepG2.2.15细胞(HBV-DNA克隆转染的人肝癌细胞2.2.15细胞系)生长曲线的影响及其浓度依赖性；采用荧光定量PCR法和ELLSA法检测该方在HepG2.2.15细胞上对HBV-DNA及两抗(HBsAg、HBeAg)分泌的影响；通过PCR法和Western Blot法分别检测该方对乙肝病毒癌基因HBV-X基因和趋化因子IP一10的影响。结果1.珍珠草复方在原代鸭胚肝细胞上抗乙肝病毒的实验(1)从购买的鸭胚中提取25u1左右的鸭胚尿囊液,筛选出先天感染DHBV的阳性鸭胚(阴性者为未感染DHBV的鸭胚)；(2)通过对不同日龄、不同培养基、加胎牛血清与不加血清三个条件的摸索发现,选用14日龄的鸭胚、不含血清的William’sE培养基更适于原代鸭胚肝细胞的生长,其病毒载量稳定；(3)通过监测先天感染和后天感染(用100u1强阳性鸭血清感染)DHBV的鸭胚肝细胞上清中病毒载量的动态变化,发现先天感染DHBV的鸭胚肝细胞病毒载量稳定在108copies/ml以上,且变化不大,较之后天感染者更适于实验需要；(4)不同浓度的珍珠草复方对原代鸭胚细胞的破坏率分别为：71.94、41.33、—、19.39、21.94、15.82、11.2%,当浓度为100mg/ml时,细胞出现空泡、脱落,破坏率达71.94%,当其浓度为50mg/m1时,细胞形态大致正常,计算得出,珍珠草复方对原代鸭胚肝细胞的半数毒性浓度TC50为59.95mg/ml；(5)在无毒浓度下珍珠草复方高剂量组(50mg/m1)在给药后第三天时DHBV-DNA明显下降(组间、组内比较均为P<0.01),而第六天时组内比较无明显下降(P>0.05),而在停药第三天时,组内和组间比较又有显著性差异；珍珠草复方中(12.5mg/ml)、低剂量组(3.12mg/m1)则在给药后和停药后,培养上清中的DHBV-DNA均下降(组间、组内比较均为P<0.01)。2.珍珠草复方在HepG2.2.15细胞上抗乙肝病毒的实验(1)珍珠草复方在设定的8个浓度(100；50；25;12.5;6.25;3.12;1.56;0.78mg/m1)下,对HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)为35.7mg/m1；珍珠草复方在浓度为50mg/ml时,细胞出现空泡、脱落；破坏率达59.59%,当其浓度为25mg/m1时,细胞形态大致正常；(2)珍珠草复方抑制HBsAg的半数有效浓度(IC50)为7.23mg/ml,对抑制HBeAg的半数有效浓度(IC50)为5.89mg/ml,珍珠草复方对HBsAg和HBeAg的治疗指数,即TI值分别为4.49和6.06;(3)珍珠草复方不同浓度(50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78mg/m1)与阳性药物阿昔洛韦(ACV,0.10mg/ml)相比,均能降低HepG2.2.15细胞上清中HBV-DNA定量拷贝数(组间比较、组内比较p<0.01);(4)与正常对照组相比,阳性药物阿昔洛韦组(ACV,0.10mg/ml),珍珠草复方高(30mg/m1)、中(15mg/m1)、低(7.5mg/m1)剂量组的HBV-X基因表达量均明显降低(组间比较、组内比较P<0.01)；在对趋化因子IP—10的研究中,与正常对照组相比,阳性药ACV组(0.10mg/m1)细胞分泌的IP—10量略有增加(P>0.05),而珍珠草复方高(30mg/ml)、中(15mg/m1)剂量组细胞分泌的IP-10量均有所降低。结论1珍珠草复方在原代鸭胚肝细胞上的实验珍珠草复方在原代鸭胚肝细胞上的实验说明,中药珍珠草复方具有抗鸭乙肝病毒的作用,其机制可能与该方能够降低原代鸭胚肝细胞DHBV-DNA病毒载量有关。2珍珠草复方在HepG2.2.15细胞上的实验该实验说明珍珠草复方能够有效抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg,并且能够抑制细胞上清中HBV-DNA载量,并且对乙肝病毒癌基因HBV-X基因具有一定的抑制作用,能够降低趋化因子IP—10的表达,说明该方不仅具有抗乙肝作用,并且具有一定的抗肝癌作用,机制可能与该方能够抑制病毒癌基因和减轻肝损伤有关。