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光学纯邻氯苯甘氨酸是一种具有广泛用途的药物中间体,其中(S)-邻氯苯甘氨酸在全球热销的“重磅炸弹”药物氯吡格雷合成中扮演着不可或缺的重要手性中间体角色。青霉素G酰化酶(PGA)对含苯环的酰基侧链有高度立体选择性,能够选择性的将苯乙酰化的外消旋邻氯苯甘氨酸水解,生成(S)-邻氯苯甘氨酸,而R-型的酰化衍生物保持构型不变,未水解的R-型底物进行消旋化反应继续循环拆分,以此来建立立体选择性青霉素G酰化酶催化生产(S)-邻氯苯甘氨酸的生产工艺。本论文首先构建了青霉素G酰化酶基因工程菌,研究了青霉素G酰化酶在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达情况。以大肠杆菌为宿主菌时,选择pCDFDute-1作为表达载体,构建重组菌Escherichia coli BL21(DE3)/pCDFDute-PGA,通过菌落 PCR 和 SDS-PAGE 分析,证明重组菌已构建成功,但酶活较低。以枯草芽孢杆菌为宿主时,选择pPZW103作为表达载体,构建重组菌Bacillus subtilis WB800/pPZW103-PGA,SDS-PAGE分析证明重组菌构建成功,重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA可以胞外表达青霉素G酰化酶。以重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA为出发菌株,通过单因素法得出了菌株最佳的青霉素G酰化酶产酶条件:可溶性淀粉10 g/L、蛋白胨 12g/L、酵母粉 3g/L、NaCl10g/L;pH7.5、培养温度37℃、装液量80mL/500mL,培养28h,青霉素G酰化酶的表达水平由最初的7.34 U/mL提高至18.23 U/mL,相比于优化前酶活提高了 2.48倍。在S L发酵罐中对重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA进行了放大培养。对重组菌B.subtilis WB800/pPZW103-PGA产青霉素G酰化酶进行了分离纯化和部分酶学特性的研究。通过硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水作用层析等蛋白质纯化技术,得到了电泳纯的青霉素G酰化酶。青霉素G酰化酶的纯化倍数为4.6倍,酶活回收率为55.5%,含有大小约为24.2 kDa和61.4 kDa的α和β两个亚基。纯化的PGA在偏碱性的条件下酶活最高,最适宜的转化pH值范围为9.0-10.0。该酶最适反应温度为50 ℃,在40 ℃和50 ℃半衰期分别为75.4 h和24.8h。Fe2+、Ag+、Al3+和SDS对PGA有较强的抑制作用,Co2+对酶活有促进作用,表面活性剂吐温-80和山梨醇对酶活影响不明显。对该酶的底物特异性进行研究,重组PGA对各个底物均具有较高的催化活性和立体选择性,反应结束后产物e.e.值均在99.9%以上,对各底物都是S型选择性。测定了重组PGA对五种不同底物的米氏常数Km、最大反应速率Vm、催化常数kcat及表观二级速率常数kcat/Km。通过分子对接阐明了青霉素G酰化酶的催化机理同时也解释了酶对五种底物催化差异的原因。论文最后研究了重组PGA催化拆分苯乙酰化的外消旋邻氯苯甘氨酸制备(S)-邻氯苯甘氨酸的催化条件。以pH 10.0的氨水溶液作为反应体系,反应温度40 ℃,确定酶浓度0.126 mg/mL,当底物浓度为110 mM时,产物浓度达48.11mM,e.e.p>99.9%。通过分批补料,底物消耗180 mM,最终产物浓度达到79.53 mM。经产物的分离和提取,制备(S)-邻氯苯甘氨酸3.5 g,总收率达47.15%。样品经旋光仪和核磁共振、液相色谱表征,表明其化学纯度和光学纯度均达到99%以上。对未反应的R-底物进行了外消旋化研究,用于循环拆分,消旋率100%,消旋收率达94.7%,同时对副产物苯乙酸也进行了分离,收率69.7%。