目的:随着细胞免疫学和分子生物学的发展,细胞免疫治疗已在临床实验中开展,并取得一定的疗效。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells,简称CIK)作为一种新型免疫活性细胞,已经用于多种恶性肿瘤的过继免疫治疗中。树突状细胞(dendritic cells,简称DC)是迄今发现的功能最强的抗原提呈细胞(APC),它通过处理、提呈抗原而介导机体免疫反应。由于很多肿瘤宿主缺乏功能性DC而不能诱发抗原特异性T细胞免疫应答,故如何在体外诱导功能性DC用于主动免疫治疗,具有重要临床意义。研究报道,FLT3配体(FLT3-L)作为一种细胞因子,可以成功诱导成熟DC的生长,并且诱导浆细胞样DC的生长,增加DC的数量,增强DC的特异性。作为经典的DC诱导刺激因子,GM-CSF在DC培养中的作用已得到肯定。本研究旨在探讨相同剂量的FLT3-L和GM-CSF在诱导成熟DC的体外培养过程中的作用,以及不同的DC-CIK共培养方式诱导的成熟CIK的特异性免疫表型表达以及对肿瘤细胞杀伤活性的差异,从而为临床DC-CIK治疗提供参考。方法:实验的第一部分:细胞取自正常人外周血单个核细胞。使用FLT3-L诱导DC成熟组作为实验组,GM-CSF诱导DC成熟组作为对照组,分离外周血贴壁细胞培养DC,隔日添加细胞因子,并按计划分别于培养过程中行流式细胞学检查分析不同的细胞因子诱导DC的免疫表型的差异。实验的第二部分:细胞来源有两种:EBV感染所致的噬血细胞综合症患者的外周血单个核细胞、AML-M4缓解期患者的外周血单个核细胞。EBV感染噬血细胞综合症患者DC培养过程中加入EBV抗原肽后与CIK共培养,比较是否可以培养出克隆性增强的CIK,从而提高CIK的抗瘤活性。AML-M4缓解期患者分别使用FLT3-L/GM-CSF两种细胞因子诱导培养成熟DC,同时培养CIK细胞,待DC培养成熟后加入CIK,进行DC-CIK共培养。培养前后DC分别进行细胞计数、行流式细胞学检查;培养前后CIK分别进行细胞计数、流式细胞学检查、基因扫描图谱分析、杀伤实验。通过一系列的实验分析,选择DC-CIK的最佳培养方案。结果:1关于两种细胞因子对正常人DC诱导培养的影响实验组与对照组细胞数均随细胞培养时间的延长逐渐减少,两组间数值无明显差异。培养前各组细胞总数2.00±0.10×107,培养第3天细胞计数FLT3-L组1.10±0.04×107,GM-CSF组1.20±0.03×107,培养第7天计数:FLT3-L组0.80±0.04×107,GM-CSF组0.80±0.02×107,培养第10天计数:FLT3-L组0.60±0.02×107,GM-CSF组0.53±0.01×107。流式细胞学分析,培养前CD14+细胞11.41%,CD83+细胞0.28%,CD80+细胞0.01%,CD86+细胞1.32%,CD4+CD123+细胞1.23%;FLT3-L培养后CD14+细胞49.22%,CD83+细胞6.96%,CD80+细胞33.48%,CD86+细胞52.05%,CD4+CD123+细胞4.25%;GM-CSF培养后CD14+细胞72.21%,CD83+细胞2.90%,CD80+细胞41.23%,CD86+细胞68.31%,CD4+CD123+细胞1.16%;培养后成熟的DC细胞增多,比较两种细胞因子诱导培养的DC表型有显著差异,其中GM-CSF组诱导的成熟DC百分比(CD80+细胞和CD86+细胞)较FLT3-L组高,FLT3-L组CD4+CD123+细胞比例高于GM-CSF组,而CD4+CD123+细胞被认为是浆细胞样DC的表面标志。2 EBV感染患者DC-CIK的培养效果的比较研究细胞生长状态及细胞计数:DC细胞培养3天后细胞数目未发生明显变化。培养第2天于倒置显微镜下可见部分细胞出现毛刺状突起,呈现半贴壁状态。CIK细胞于第3天加入MabCD3和MabCD28,经过24小时的培养后(总生长天数的第4天)出现增殖,倒置显微镜下可见细胞呈现集落样生长,DC-CIK共培养组与CIK组的细胞增殖速度无显著性差异,培养14天后,DC-CIK组细胞数目和CIK组细胞数目分别为培养前6.3倍及5.8倍。培养期内细胞存活率都在95%以上。流式细胞术细胞免疫表型分析:培养前DC :HLA-DR+CD86+细胞12.05%,CD83+细胞2.32%,CD80+细胞0.00%;GM-CSF培养后DC :HLA-DR+CD86+细胞91.17%,CD83+细胞7.28%,CD80+细胞36.20%。培养前CIK: CD3+细胞74.88%,CD8+细胞30.02%,CD3+CD8+细胞28.08%,CD3+CD56+细胞1.27%;培养后空载DC-CIK:CD3+细胞97.59%,CD8+细胞55.49%,CD3+CD8+细胞54.95%,CD3+CD56+细胞8.50%;培养后负载肽DC-CIK:CD3+细胞95.62% , CD8+细胞53.55% , CD3+CD8+细胞52.89% ,CD3+CD56+细胞8.44%。培养前后基因谱型图分析:分析培养前后TCRβ24个家族,培养前各家族峰型不明显,峰值较低,只有散在家族出现高斯分布,培养后除负载肽DC-CIK组细胞在TCRβ5.2家族出现克隆性增强的单克隆峰外,培养后空载DC-CIK/负载肽DC-CIK组细胞在其余TCRβ24个家族谱型图中均出现高斯分布现象(正态分布)。杀伤实验结果(IFN-γ分泌值):分别以5:1、10:1和20:1的效应细胞和靶细胞比例混合CIK(效应细胞)和DC(靶细胞)细胞、加入EBV肽培养3小时后取上清,三倍稀释后,使用IFN-γELISA试剂盒测定上清液中IFN-γ的含量。培养前CIK、培养后空载DC-CIK和负载肽DC-CIK组,测得的比值分别为1:1.4:2.7(效靶5:1);1:1.2:1.7(效靶10:1);1:1.1:1.7(效靶20:1),表明按不同的效靶比混合后,负载肽DC-CIK组IFN-γ分泌量为空载组的1.4~1.9倍左右,培养后负载肽组CIK对DC的杀伤活性明显强于空载组。3 AML-M4缓解期期患者DC-CIK的培养方法比较研究细胞生长状态及细胞计数:DC培养过程分别加入FLT3-L/GM-CSF,两组DC于培养3天后细胞数目无明显变化。第2天于倒置显微镜下可见部分细胞出现毛刺状突起,呈现半贴壁状态,两组DC形态未见明显异常。CIK细胞于第3天加入MabCD3和MabCD28,经过24小时的培养后(总生长天数的第4天)出现增殖,倒置显微镜下可见细胞呈现集落样生长,不同DC-CIK共培养组细胞增殖速度无显著性差异,培养14天后,FLT3-L诱导DC-CIK组细胞数目和GM-CSF诱导DC-CIK组细胞数目分别为培养前6.6倍及6.2倍。培养期内细胞存活率在95%以上。流式细胞术细胞免疫表型分析:培养前DC :HLA-DR+CD86+细胞6.90%,CD83+细胞0.27%,CD80+细胞0.13%,CD14+细胞73.85%;FLT3-L培养后DC :HLA-DR+CD86+细胞76.79%,CD83+细胞3.17%,CD80+细胞11.87%,CD14+细胞55.33%;GM-CSF培养后DC :HLA-DR+CD86+细胞43.87%,CD83+细胞1.40%,CD80+细胞6.74%,CD14+细胞19.80%。两种细胞因子诱导产生成熟DC数目均有所增加,比较两组之间DC细胞成熟度,FLT3-L组高于GM-CSF组。培养前CIK:CD3+细胞78.57%,CD8+细胞61.54%,CD4+细胞22.85%,CD3+CD8+细胞55.20%,CD3+细胞CD56+细胞5.03%;FLT3-L诱导DC-CIK:CD3+细胞91.43%,CD8+细胞81.83%,CD4+细胞12.59%,CD3+CD8+细胞80.29%,CD3+CD56+细胞47.31%;GM-CSF诱导DC-CIK:CD3+细胞91.97%,CD8+细胞78.6%,CD4+细胞12.56%,CD3+CD8+细胞76.90%,CD3+CD56+细胞57.72%。培养后CD3+、CD8+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞均较培养前增多,平均增幅分别为12.09%、18.67%、23.40%、47.48%;CD4+细胞较培养前减少,平均减少10.27%。FLT3-L组和GM-CSF组两组间比较,各项平均增幅不明显,但GM-CSF组CD3+CD56+细胞水平较FLT3-L组增高约10.41%。培养前后基因谱型图分析:分析培养前后TCRβ24个家族,培养前各家族谱型不明显,只有少数家族出现高斯分布现象,培养后各家族均出现高斯分布现象,比较培养后两组基因谱型图,未见明显差异。IFN-γ分泌值:分别以5:1的效应细胞和靶细胞比例混合CIK(效应细胞)和DC(靶细胞)细胞进行培养。培养3小时后,分别取上清5倍稀释后使用IFN-γELISA试剂盒测定上清液中IFN-γ的含量,培养前CIK组、FLT3-L诱导DC-CIK组、GM-CSF诱导DC-CIK组三组各三个复孔平均值比值为1:4:3,培养后IFN-γ分泌值均较培养前明显增高,FLT3-L诱导DC-CIK组IFN-γ分泌值较GM-CSF诱导DC-CIK组增高33.3%。结论:1通过实验摸索,我们用缩短培养时间的14天DC-CIK共培养方法,成功培养出树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞,建立并优化了DC-CIK的培养体系。2对EB病毒感染相关性噬血细胞综合征患者进行CIK治疗是可行的,可以作为临床辅助治疗方式,在DC的培养过程中加入EB病毒相关的抗原肽可以刺激T淋巴细胞产生克隆性增强的生长,提高T淋巴细胞的杀伤力。3 AML患者进行DC-CIK治疗是可行的,可以作为AML缓解期病人的一种辅助性治疗方式,减少微小残留病变。4 FLT3-L与GM-CSF相比,FLT3-L在对DC的体外诱导培养中,显示出了一些优越性,其中FLT3-L对浆细胞样DC的刺激作用强于GM-CSF。